膈下逐瘀汤对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠Wnt／β-catenin 通路的影响

孙旭熊芬黄育生闫雪蔡庆群丘振文*

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405； 2.广州中医药大学岭南医学研究中心，广东 广州510405）

肝纤维化是肝脏受到病毒、酒精、药物等生物、化学或免疫因素损伤后进行组织修复的病理生理过程，其本质是肝星状细胞激活后导致的细胞外基质大量聚集［1-2］。若肝纤维化没有得到逆转或改善则会进一步发展为肝硬化，据统计每年死于肝硬化的人数达到100万［3］。肝纤维化存在逆转可能，因此，开展肝纤维化治疗具有重要意义。

Wnt 信号通路是调控细胞生长与分化的重要信号通路，其异常表达与纤维化疾病紧密关联。当Wnt 信号通路被激活后，异常表达的Wnt 蛋白参与肝内炎症、脂代谢、氧化应激等反应，导致酒精性脂肪肝、肝纤维化等慢性肝病的发生［4］。具有活血化瘀作用的丹参、红景天、龙血竭等能抑制Wnt／β-catenin 信号通路的异常激活，起到抗肝纤维化的作用［5-7］。

膈下逐瘀汤出自《医林改错》，具有活血逐瘀、破症消结之功效，主治积聚痞块、痛不移处、卧则腹坠、肾泻、久泻由瘀血所致者［8］。中医认为肝纤维化多由湿热阻滞、肝气郁滞而致脉道不通、瘀血阻络所致，属本虚标实之证，本虚以脾气虚弱和肝肾阴虚为主，“因虚致积”可促使疾病进一步发展为肝硬化或肝癌，标实以水停、血瘀为主［9］。因此，本研究通过膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠Wnt／β-catenin 通路的调控作用，阐明膈下逐瘀汤对肝纤维化的治疗作用，以期指导临床应用。

1 材料

1.1 动物 清洁级健康成年雄性SD 大鼠48只，鼠龄8～12周，体质量（200±20）g，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号SYXK（粤）2018-0092，饲养于广东药科大学实验动物中心，实验室温度24～25 ℃，相对湿度50%～60%。标准饲料、饮用水由广东药科大学动物实验中心提供，高脂低蛋白饲料配方为在79.5%标准饲料基础上添加20% 猪油和0.5% 胆固醇，适应性饲养1 周。

1.2 试剂与药物 膈下逐瘀汤由五灵脂6 g、当归9 g、川芎6 g、桃仁9 g、牡丹皮6 g、赤芍6 g、乌药6 g、延胡索3 g、甘草9 g、香附5 g、红花9 g、枳壳5 g 组成，饮片购自广州中医药大学第一附属医院，经广州中医药大学第一附属医院副主任中药师黄光荣鉴定为正品，将上述饮片按比例加入10 倍量水煎煮，过滤，滤液浓缩至含生药量1.58 g／mL，4 ℃保存备用。秋水仙碱片（西双版纳药业有限责任公司，批号H53021369），溶于蒸馏水，配制成质量浓度为11 mg／L；CCl4（分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号5623-5）；花生油（山东鲁花集团有限公司，批号Q／LLH0015S）；HE 染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号G1005）；天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、透明质酸（HA）试剂盒、层黏蛋白（LN）试剂盒、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）试剂盒、Ⅳ型胶原（CⅣ）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20190518、20190409、20190814、20190730、20190916、20191011）；TRIzol 试剂（美国Sigma 公司，批号187022024）；RNA 提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司，批号GK4175）；实时荧光定量PCR 扩增试剂盒（日本TaKaRa 公司，批号ST728A）；磷酸酶抑制剂［生工生物工程（上海）股份有限公司，批号B546021-0250］；蛋白酶抑制剂［安诺伦（北京）生物科技有限公司，批号HY-K0010］；SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液、DAB 显色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号ST627、ST627）；Wnt-1、β-catenin、p-GSK3β、GSK3β 抗体（美国Affinity 公司，批号AF2115、AF6266、AF2016、AF2017）；GAPDH抗体、山羊抗兔HRP 标记二抗、ECL 试剂盒（杭州弗德生物科技有限公司，批号FD0063、FDR007、P0023A）；BCA试剂盒（美国Thermo Scientific 公司，批号VK314219）；PVDF 膜（美国Millipore 公司，批号402190QR）。

1.3 仪器 -80 ℃超低温冰箱（美国Sigma 公司）；高速低温离心机（美国Thermo Scientific 公司）；组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；脱水机（意大利Diapath公司）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；病理切片机（德国Leica 公司）；TBA-2000FR 全自动生化分析仪（日本东芝公司）；病理切片扫描仪（匈牙利3D-histech 公司）；垂直电泳槽、转移电泳槽、MicroCL17R 实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad 公司）；电泳仪（北京百晶生物技术有限公司）；SK-L180-E 摇床（美国Scilogex 公司）；电子天平［奥豪斯仪器（上海）有限公司］；化学发光显影仪（北京赛智创业科技有限公司）。

2 方法

2.1 分组与造模 48 只大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、秋水仙碱组、膈下逐瘀汤组，每组12 只。参考文献［10］报道，以CCl4诱导制备肝纤维化模型。造模组大鼠于第1 天腹腔注射含40%CCl4花生油3 mL／kg，之后每3 d腹腔注射2 mL／kg，连续8周，正常组大鼠腹腔注射等体积花生油。首次注射后第2 天开始给药，膈下逐瘀汤组大鼠灌胃给予药液7.29 g／kg［11］，秋水仙碱组大鼠灌胃给予秋水仙碱混悬液0.11 mg／kg，正常组和模型组大鼠灌胃给予生理盐水10 mL／kg，每天1次，每3 d 称定体质量1次以调整药量，共8周，末次给药后，禁食不禁水12 h 后腹腔注射6%水合氯醛7 mL／kg 麻醉取材。

2.2 行为学评价 每天观察并记录大鼠的精神状况、饮食及活动、毛发光泽度等一般情况。

2.3 肝脏指数评价 大鼠麻醉后，开腹摘取肝脏，观察肝脏形态并称定质量，计算脏器指数。

2.4 肝组织病理学观察 将约1 cm×1 cm 大小的肝组织置于4%多聚甲醛浸泡72 h，依次进行梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片（厚度3 μm），脱蜡，行苏木精-伊红（HE）染色，于显微镜下进行组织形态学观察。

2.5 生化法检测血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平 腹主动脉取血，4 ℃静置4 h，3 000 r／min 离心15 min，分离血清，严格按照相应试剂盒说明书操作，检测大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平。

2.6 RT-qPCR 法检测肝组织中Wnt-1、β-catenin、GSK-3βmRNA 表达 采用TRIzol 试剂提取肝组织总RNA。按照逆转录试剂盒的操作说明书将提取的总RNA 逆转录成cDNA，采用SYBR Green 进行两步法实时荧光定量PCR 反应，以GAPDH作为内参。每个样品重复3次，以2-ΔΔCT分析计算各组mRNA 表达情况。引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot 法检测肝组织Wnt-1、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β 蛋白表达 剪取肝组织约30 mg 于玻璃匀浆器中，加入400 μL RIPA 裂解液和100×磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，冰上充分研磨，将匀浆液于4 ℃条件下12 000 r／min离心15 min，取上清液采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒对肝组织蛋白进行定量分析后，按照4∶1 的比例加入上样缓冲液（5×），沸水浴15 min 使蛋白变性，制作10%分离胶与5%浓缩胶，蛋白上样，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，在低温条件下，恒流300 mA，60 min 转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭PVDF 膜2 h，TBST 洗涤3次，加入一抗孵育过夜，TBST 漂洗3次，每次5 min；二抗稀释后室温孵育30 min，TBST 漂洗3次，每次5 min。以GAPDH 为内参，ECL 试剂盒显影成像，利用GelAnalyze 对蛋白条带进行图像分析，记录灰度值，通过计算目的条带与内参的灰度值比值来分析Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β 蛋白表达。

2.8 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，数据以（）表示，采用GraphPad Prism 9 软件进行方差分析和作图，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠一般形态、肝脏形态和肝脏指数的影响 正常组大鼠精神状态良好、活泼好动、皮毛洁白光泽；模型组大鼠行动迟缓，毛发枯乱、偏黄，死亡1 只；秋水仙碱组和膈下逐瘀汤组大鼠精神状态良好，行动较正常组迟缓，毛发黯淡无光泽，秋水仙碱组死亡1只，见图1。

图1 膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠行为、形态的影响

正常组大鼠肝脏组织呈鲜亮的红褐色，大小适中，无肿大，质地触及柔软光滑且富有弹性，组织边缘完整无钝感；模型组大鼠肝脏组织呈现出肿胀状态，颜色呈土黄色或灰黄色，黯淡无光泽，触之质地油腻、粗糙不平、无弹性且有颗粒感，组织边缘变钝且显韧硬；膈下逐瘀汤组和秋水仙碱组大鼠肝脏组织质地、色泽介于正常组和模型组之间，无正常组大鼠肝组织颜色鲜亮且光滑，但较模型组大鼠肝脏组织边缘整齐，肝脏组织的整体状态接近正常组，见图2。

图2 膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠肝脏形态的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝脏指数升高（P＜0.01）；与模型组比较，膈下逐瘀汤组和秋水仙碱组大鼠肝脏指数无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图3 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏指数的影响（， n＝9）

3.2 膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠肝脏组织病理变化的影响 正常组大鼠肝脏内小叶结构清晰、肝细胞排列整齐；模型组大鼠肝脏内小叶结构破坏、可见大量脂滴、炎症浸润和坏死细胞，汇管区纤维结缔组织增生；膈下逐瘀汤组和秋水仙碱组大鼠可见胶原纤维增生和炎性细胞减少，纤维间隔薄且仅分布于汇管区周围，阳性染色面积降低，见图4。

图4 膈下逐瘀汤对大鼠肝脏组织病理学的影响

3.3 膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠血清中ALT、AST 活性的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST 活性升高（P＜0.01）；与模型组比较，秋水仙碱组和膈下逐瘀汤组大鼠血清中ALT、AST 活性降低（P＜0.05，P＜0.01），见图5。

图5 膈下逐瘀汤对大鼠血清ALT 和AST 活性的影响（， n＝9）

3.4 膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，秋水仙碱组和膈下逐瘀汤组大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平降低（P＜0.01），见图6。

图6 膈下逐瘀汤对大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平的影响（， n＝5）

3.5 膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠肝组织中Wnt-1、βcatenin、GSK-3βmRNA 表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝组织中Wnt-1、β-cateninmRNA 表达升高（P＜0.01），GSK-3βmRNA 表达降低（P＜0.05）；与模型组比较，秋水仙碱组和膈下逐瘀汤组大鼠肝组织中Wnt-1、β-cateninmRNA 表达降低（P＜0.01），GSK-3βmRNA 表达升高（P＜0.01），见图7。

图7 膈下逐瘀汤对大鼠肝组织Wnt-1、β-catenin、 GSK-3β mRNA 表达的影响（， n＝5）

3.6 膈下逐瘀汤对肝纤维化大鼠肝组织中Wnt-1、βcatenin、GSK-3β、p-GSK-3β 蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝组织中Wnt-1、β-catenin、p-GSK-3β／GSK-3β 蛋白表达升高（P＜0.01），GSK-3β 蛋白表达降低（P＜0.05）；与模型组比较，膈下逐瘀汤组大鼠肝组织中Wnt-1、β-catenin、p-GSK-3β／GSK-3β 蛋白表达降低（P＜0.01，P＜0.05），GSK-3β 蛋白表达升高（P＜0.05），见图8～9。

图8 各组大鼠肝组织中Wnt-1、β-catenin、p-GSK-3β、GSK-3β 蛋白表达

图9 膈下逐瘀汤对大鼠肝组织中Wnt-1、β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β／GSK-3β 蛋白表达的影响（， n＝5）

4 讨论

肝纤维化是慢性肝病进展至肝硬化、肝癌的中心环节，中医将其归于“肝著”“臌胀”“积聚”“黄疸”等范畴［9，12］。现今尚无抗肝纤维化的有效药物，部分西药如秋水仙碱等，因不良反应大在临床难以推广。中医认为，纤维化病机为湿热疫毒内蕴，气滞瘀血阻络，治法以活血化瘀、疏肝解郁、养血柔肝为主［13］。

膈下逐瘀汤由五灵脂、当归、川芎、桃仁、牡丹皮、赤芍、乌药、延胡索、甘草、香附、红花、枳壳组成，具有改善微循环、抑制炎症的作用，主治腹部瘀血积块等病证，与肝纤维化发病机制和部位相符［14］。本研究发现，膈下逐瘀汤能降低肝纤维化大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平，减少坏死细胞和炎性浸润，对肝纤维化大鼠具有保护作用。

Wnt／β-catenin 通路广泛参与细胞分化、组织修复等过程，在正常状态下处于低表达或沉默状态，当发生纤维化和肿瘤时，可被异常激活出现高表达［15-17］。β-catenin 为多功能蛋白，可介导信号转导和细胞黏附［18］。当Wnt 相关配体与细胞膜上Frizzled 受体结合后，通路被异常激活，细胞质中GSK-3β 发生磷酸化，导致β-catenin 在细胞质中积累并转移至细胞核并激活下游靶基因。抑制β-catenin 高表达，阻断Wnt／β-catenin 通路，抑制肝星状细胞增殖和活化，进而延缓肝纤维化发生［19-22］。

目前，膈下逐瘀汤对肝纤维化的探索除了集中在临床研究［23-24］，对于临床前动物研究也在不断深入，如赵海军等［25］发现，膈下逐瘀汤能降低CCl4所致肝纤维化大鼠血清中ALT、AST、LN、HA 水平，升高血清蛋白和总蛋白表达，这与本研究部分结果一致。此外，膈下逐瘀汤可降低转化生长因子-β1 和α-平滑肌肌动蛋白等致纤维化因子水平，下调缺氧诱导因子-1α 及血管内皮细胞生长因子，改善血管新生［26-27］；在信号通路方面，杨婧等［28-29］发现，膈下逐瘀汤可活化Akt-Nrf2 通路增强大鼠肝脏谷胱甘肽和硫氧还蛋白系统，减轻组织氧化应激，延缓纤维化进展。本研究在已证实膈下逐瘀汤对肝纤维化有积极治疗作用的前提下，首次探索了膈下逐瘀汤通过Wnt／β-catenin 通路干预肝纤维化的可能性。结果显示，Wnt-1、β-catenin 在肝纤维化大鼠肝组织中表达升高，膈下逐瘀汤可下调Wnt-1、βcatenin、p-GSK-3β／GSK-3β 蛋白表达，上调GSK-3β mRNA及蛋白表达。

综上所述，Wnt／β-catenin 通路在肝纤维化大鼠肝脏组织中存在异常激活现象，膈下逐瘀汤可通过抑制GSK-3β 磷酸化，促进β-catenin 降解，减少β-catenin 在细胞内积聚，进而阻断Wnt／β-catenin 通路激活。本研究证实了Wnt／βcatenin 通路与肝纤维化的相关性，进一步探究了膈下逐瘀汤改善肝纤维化的潜在机制，为抗肝纤维化研究提供了新的思路和方向。