补肾活血方对肾虚血瘀型复发性流产小鼠胚胎植入及子宫免疫微环境的影响

韩永梅，卫爱武

(河南中医药大学，河南 郑州 450046)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指连续发生至少2次妊娠不足20周胎儿丢失的病理现象，属于育龄期女性常见病和疑难病[1]。研究显示，胎盘植入的局部微环境异常改变是导致胎儿丢失的主要原因，胎盘植入过程与胚胎、子宫内膜等多因素相关，其中免疫微环境调节至关重要[2]。中医学在治疗复发性流产方面具有独特优势，现代中医学通过聚类分析发现，肾虚血瘀是临床复发性流产患者最为常见的证型，认为肾虚冲任不固为本，瘀血阻滞胞宫为标[3]。补肾活血方是根据复发性流产病机及辨证论治原则，该方由中医经典补肾安胎方药寿胎丸《医学衷中参西录》及养血活血安胎方药芎归汤《景岳全书·妇人规》配伍而成，具有补肾活血之功效[4]。为观察补肾活血方对常规西药对肾虚血瘀型复发性流产的辅助效果，本研究通过建立肾虚血瘀型复发性流产小鼠模型，分析其对胚胎种植及子宫免疫微环境的影响及机制，为临床复发性流产的治疗提供依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级雌性CBA/J小鼠72只，雄性DBA/2小鼠30只，BALB/c小鼠6只，均为8周龄，体质量18～22 g，购自北京科宇动物养殖中心，动物生产许可证号SCXK(京)2018-0010。

1.2 药物 菟丝子12 g，川续断、桑寄生、阿胶、川芎各6 g，当归9 g，药材均购自上海市同仁堂药业股份有限公司。除阿胶外，其余药材加水浸泡30 min，武火煎煮30 min，取药液200 mL过滤，再次加水文火煎煮30 min，取药液200 mL过滤；两次药液合并煎煮，阿胶烊化混入药液，制成含生药1 g/mL浓煎液，4 ℃保存备用。地屈孕酮片(荷兰Abbott Biologicals B.V.公司，国药准字H20170221，规格10 mg)。

1.3 试剂 小鼠γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(批号C12592、C3021，美国Cygnus公司)；大鼠抗小鼠CD4+、CD8+单抗(批号PAB16751、PAB16420，美国AbD Serotec公司)；逆转录试剂盒(批号RR047 A，日本TaKaRa公司)；实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)试剂盒(批号WE0129-DBI，北京百奥莱博科技有限公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量分析试剂盒(批号QPBCA-1KT，美国Thermo公司)；大鼠抗小鼠肿瘤坏死因子受体I型(tumor necrosis factor receptor type I，TNFR1)、Fas相关死亡域蛋白(Fas-related death domain protein，FADD)、B淋巴细胞瘤-2基因(B lymphocyte tumor-2 gene，Bcl-2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(containing aspartate proteolytic enzyme-8，caspase8)一抗(批号ab231925、ab119059、ab218123、ab25901，英国Abcam公司)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记IgG二抗(批号23-72101，武汉艾迪抗生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 分组和模型制备 72只雌性CBA/J小鼠按照体质量随机分组法分为正常组、模型组、西药组、高剂量组、低剂量组和联合组，每组12只。除正常组外，其余各组制备肾虚血瘀型复发性流产小鼠模型[5]，灌胃0.2 mL羟基脲，同时皮下注射12 μL肾上腺素，连续1周；正常组小鼠灌胃0.2 mL超纯水，皮下注射12 μL生理盐水，连续1周。1周后正常组雌鼠与BALB/C雄鼠按2∶1比例合笼饲养，其余各组雌鼠与DBA/2雄鼠按2∶1比例合笼饲养1～2 d，合笼次日清晨检出阴栓或阴道分泌物将其涂片见精子则记为孕1 d。

2.2 给药方法 按照人与小鼠间的等效剂量换算[6]，小鼠灌胃地屈孕酮临床等效剂量为3.6 g/kg，补肾活血汤剂量临床等效剂量为100 g/kg。自孕1 d开始，西药组灌胃36 μg/10 g地屈孕酮片水溶剂，高、低剂量组灌胃200、100 g/kg补肾活血汤，联合组同时灌胃200 g/kg补肾活血汤和3.6 g/kg地屈孕酮片水溶剂，正常组和模型组灌胃等量生理盐水，每天1次，连续14 d。

2.3 胚胎丢失率计算 孕15 d后处死各组小鼠，剖腹取子宫组织，统计丢失胚胎数和正常胚胎数，正常胚胎呈大小均一的串珠状，胚胎中间见红色条索状胎盘，丢失胚胎呈黑色或紫褐色，大小不均一，部分胚胎萎缩。计算胚胎丢失率为丢失胚胎数占总胚胎数的比例。

2.4 组织取材 冰上纵向剖开子宫组织，剥离胚胎后，取部分子宫组织，称定质量后剪碎，按照1∶9比例加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)，立即匀浆，4 ℃预冷离心机，12 000 r/min离心10 min(离心半径10 cm)，取匀浆上清液，于-80 ℃保存备用。取部分子宫组织，置于40%中性甲醛中固定48 h备用。剥离蜕膜组织，于-80 ℃保存备用。

2.5 子宫组织病理学 取40%中性甲醛中固定的子宫组织，常规石蜡包埋，制作厚度为4 μm的连续切片，每只小鼠取5张切片，切片经脱蜡，酒精水化后进行常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，封片剂封片，光学显微镜下观察并拍摄图片。

2.6 子宫组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞检测 每只小鼠取5张切片，脱蜡至水，3% H2O2室温孵育7 min，PBS洗涤，96 ℃孵育10 min，滴加山羊血清，室温孵育30 min，滴加大鼠抗小鼠CD4+、CD8+单抗(PBS代替一抗为阴性对照)，4 ℃过夜，滴加生物素标记兔抗大鼠IgG单抗，37 ℃孵育25 min，PBS洗涤3次，每次5 min，滴加辣根或氧化物酶标记亲和素，37 ℃孵育25 min，PBS洗涤3次，每次5 min，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，流水终止。脱水、透明后中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍摄图片，棕色或棕褐色染色为阳性细胞，每张切片取5个随机视野，计数CD4+、CD8+T淋巴细胞数，取平均值。

2.7 子宫组织中IFN-γ、IL-4水平检测 取子宫组织匀浆上清液，采用ELISA法[7]检测IFN-γ、IL-4水平，按照试剂盒说明书操作，检测570 nm波长处吸光度值，根据吸光度-浓度标准曲线计算待测样本水平。

2.8 蜕膜组织中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8 mRNA检测 取蜕膜组织，Trizol法[8]提取总RNA，酶标仪检测260 nm和280 nm波长处吸光度(absorbance，A)值，A260/A280在1.6～1.8之间为合格，计算RNA纯度。将RNA逆转录获得互补链cDNA，SYBR Green荧光定量试剂盒进行RT-qPCR，25 μL反应体系为SYBR Premix Ex Taq 13.5 μL，10 μmol/L正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL；反应条件为95 ℃预变性90 s；95 ℃变性20 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，重复40个循环；采用2-△△CT法[9]计算目的基因相对内参β肌动蛋白(β-actin)表达量，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.9 蜕膜组织中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白表达检测 取蜕膜组织，于液氮中研磨后转至离心管，加入0.5 mL细胞裂解液于冰上裂解25 min，沸水水浴10 min变性，12 000 r/min离心15 min(离心半径10 cm)，取上清进行BCA蛋白总量检测。取40 μg蛋白与等量Loading buffer混匀，进行SDS-PAGE，电压80 V至指示剂进入分离胶，120 V电泳至结束，电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，封闭液室温封闭2 h，Tris盐酸吐温缓冲液(Tris-Hcl tween hydrochloride buffer，TBST)洗涤3次，每次10 min，加入一抗TNFR1(1∶200)，FADD(1∶300)，Bcl-2(1∶300)，caspase8(1∶500)，4 ℃过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入相应的稀释二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min，加入电化学发光法显影、定影，凝胶成像系统扫描拍照，Image J图像分析软件分析条带灰度值，目的蛋白与内参β-actin灰度值的比值表示蛋白相对表达量。

3 结果

3.1 补肾活血方对小鼠胚胎丢失率的影响 正常组、西药组、高剂量组和联合组均造模成功(妊娠10只)，模型组和低剂量组造模成功9只。如表2所示，与正常组比较，模型组小鼠胚胎丢失率升高(P<0.05)；与模型组比较，各给药组胚胎丢失率均降低(P<0.05)，并且联合组<西药组<高剂量组<低剂量组。

表2 各组胚胎丢失率比较

3.2 补肾活血方对小鼠子宫组织病理学改变的影响 如图1所示，正常组小鼠子宫组织细胞无明显异常，细胞核深染清晰；模型组小鼠子宫组织细胞核染色较浅，呈现边聚、碎裂情况；各给药组细胞核边聚和碎裂现象减少，结构清晰，其中联合组改善最为明显。

注：黑色箭头指示细胞核碎裂，绿色箭头指示细胞核边聚。图1 各组小鼠子宫组织病理学(HE，×400)

3.3 补肾活血方对小鼠子宫组织免疫微环境的影响 如表3、图2～3所示，与正常组比较，模型组小鼠子宫组织IFN-γ、CD4+、IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平均升高(P<0.05)，IL-4、CD8+水平均降低(P<0.05)；与模型组比较，各给药组小鼠子宫组织IFN-γ、CD4+、IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平均降低(P<0.05)，并且联合组<西药组和高剂量组<低剂量组；与模型组比较，各给药组小鼠子宫组织IL-4、CD8+水平均升高(P<0.05)，并且联合组>西药组和高剂量组>低剂量组；西药组和高剂量组比较，小鼠子宫组织IFN-γ、IL-4、CD4+、CD8+、IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平无明显变化(P>0.05)。

表3 各组小鼠子宫组织中IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平

注：黑色箭头指示CD4+T淋巴细胞。图2 各组小鼠子宫组织CD4+免疫组化染色图(×400)

注：黑色箭头指示CD8+T淋巴细胞。图3 各组小鼠子宫组织CD8+免疫组化染色图(×400)

3.4 补肾活血方对小鼠蜕膜组织中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8 mRNA表达的影响 如表4所示，与正常组比较，模型组小鼠蜕膜组织中TNFR1、FADD、caspase8 mRNA表达升高(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表达降低(P<0.05)；与模型组比较，各给药组小鼠蜕膜组织中TNFR1、FADD、caspase8 mRNA表达均降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表达升高(P<0.05)，其中联合组TNFR1、FADD、caspase8 mRNA表达最低，且Bcl-2 mRNA表达最高。

表4 各组小鼠蜕膜组织中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8 mRNA表达

3.5 补肾活血方对小鼠蜕膜组织中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白表达的影响 如图4～5所示，与正常组比较，模型组小鼠蜕膜组织中TNFR1、FADD、caspase8蛋白表达升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组比较，各给药组小鼠蜕膜组织中TNFR1、FADD、caspase8蛋白表达均降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)，其中联合组小鼠蜕膜组织中TNFR1、FADD、caspase8蛋白表达最低，且Bcl-2蛋白表达最高(P<0.05)。

图4 各组小鼠蜕膜组织中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白条带图

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与西药组比较，$P<0.05；与高剂量组比较，△P<0.05；与低剂量组比较，▲P<0.05。图5 各组小鼠蜕膜组织中TNFR1、FADD、Bcl-2、caspase8蛋白表达柱状图

4 讨论

复发性流产病因复杂，除遗传、解剖、内分泌等临床常见因素外，多数与免疫因素有关[10-11]。母体免疫系统对胚胎抗原的保护性免疫耐受，是维持妊娠序贯正常进行的前提条件，子宫免疫微环境异常改变可导致胚胎植入异常，最终导致流产发生[12]。临床常用地屈孕酮、黄体酮等药物治疗，但疗效仍不理想[13]。本研究结果显示，补肾活血方辅助常规西药可有效改善肾虚血瘀型复发性流产小鼠子宫免疫微环境，促进胚胎植入，其机制可能与调节TNFR1信号通路有关。

本研究发现，补肾活血方联合西药可有效降低胚胎丢失率、子宫组织IFN-γ/IL-4、CD4+/CD8+水平，提示补肾活血方辅助常规西药可有效促进肾虚血瘀型复发性流产小鼠胚胎植入，增强母体对胚胎的免疫耐受程度。《诸病源候论》提出本病为气血两虚、冲任不固、胎失荣养所致，其中肾虚血瘀是导致滑胎的关键因素，其后在多种中医著作中均有提出[14-15]。补肾活血方以补肾安胎经典方寿胎丸为主，配伍“治一切胎气不安”之养血活血安胎方芎归汤为辅。补肾活血方中菟丝子补肾益精，固摄冲任，重用为君；桑寄生、续断补益肝肾，养血安胎为臣；阿胶补血为佐；当归养血活血，川芎理气行滞为使，诸药合用共奏补肾活血、益气安胎之功效。冯晓玲等[16]临床应用补肾活血方治疗复发性流产发现，中医症状明显改善，为妊娠提供良好母体内环境。Th1细胞属于攻击性细胞，可分泌IFN-γ，诱导免疫排斥发生，IL-4由Th2细胞分泌，主要诱导免疫耐受[17]。CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群同样是调节机体免疫耐受的细胞群之一，前者具有细胞毒性作用，后者具有负性调节作用[18]。补肾活血方中多种中草药活性成分联合地屈孕酮能够更好的调节子宫免疫微环境，降低流产风险。此外，本研究发现，补肾活血方联合西药可下调蜕膜组织中TNFR1、FADD、caspase8 mRNA和蛋白表达，上调Bcl-2表达。TNFR1主要表达于蜕膜组织，FADD表达于滋养层，临床研究显示[19]，复发性流产患者TNFR1和FADD表达均异常升高，可导致血管内皮损伤，致使胚胎失养而流产。TNFR1与肿瘤坏死因子结合后，前者发生多聚化反应从而激活caspase8，启动凋亡信号通路[20]。Bcl-2是TNFR1信号通路下游的抗凋亡因子，其表达量升高可修复受损线粒体从而抑制细胞凋亡[21]。本研究中补肾活血方可辅助地屈孕酮抑制TNFR1信号通路激活，从而改善胚胎植入局部环境稳定，促进胚胎植入。