基于7.0T心脏磁共振成像探讨苍艾挥发油对正常大鼠心功能的影响

黄睿珏，温小娟，李若阳，李 博，何 博，王 磊，陈柏君，熊 磊，郜发宝*

(1.云南中医药大学基础医学院，云南 昆明 650500；2.四川大学华西医院放射科，四川 成都 610041；3.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610041；4.四川大学华西医院分子影像研究室，四川 成都 610041)

心脏磁共振作为一项安全、无创的影像检测技术，以其多参数、多序列、高分辨率等优势可综合评估心脏结构、功能、组织特征和灌注，目前广泛应用于心血管的临床诊断与科学研究，已成为心脏评估的金标准[1-4]。组织追踪技术在心脏磁共振电影序列采集成像的基础上，通过后处理软件测量不同方向上整体、局部、节段的心肌应变参数，能评估心脏整体和局部运动，具有良好的可行性与重复性[5-6]。

苍艾挥发油是基于中医传统熏香疗法，采用苍术、艾叶、藿香、花椒、香薷、佩兰、石菖蒲等多种气味清香、辛散走串、芳香开窍的药材经现代萃取工艺提炼制成的挥发油复方制剂。研究表明，苍艾挥发油经吸入给药可调节大鼠大脑多巴胺和5-羟色胺的代谢，增加脑源性神经营养因子、突触囊泡膜蛋白表达与传递效能进而改善大鼠抑郁样行为[7-8]；加快对大鼠脑缺血再灌注后的脑神经纤维束恢复，可能具有脑神经保护功能[9]；保护小鼠上呼吸道黏膜免疫系统，进而降低被动吸烟对上呼吸道的损伤[10]，但目前尚无该成分在心血管疾病领域中的研究报道。

前期发现，苍艾挥发油富含挥发性成分丁香酚[7]，对大鼠心脏移植过程中所出现的心肌缺血再灌注损伤具有心肌保护作用[11]，并且原料中的石菖蒲[12-13]对心肌梗死、急性心肌缺血损伤具有保护作用，但它作为一种由多种药材提炼合成的挥发油制剂，对心血管是否也具有安全性或保护作用尚不明确。因此，本实验首次采用7.0T心脏磁共振成像探索苍艾挥发油通过腹腔注射、灌胃、雾化吸入对正常大鼠的心肌保护作用，并评价其差异，以期为后续开展该成分在心血管疾病领域中的药效与最佳用药方式研究提供依据。

1 材料

1.1 动物 40只健康雄性SPF级SD大鼠，6～8周龄，体质量180～200 g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK(川)2015-030。研究经四川大学华西医院实验动物保护和使用委员会批准，批准号SYXK(川)2013-119。

1.2 药物 苍艾挥发油原油均由云南中医药大学提供，采用水蒸馏法提取，相关药材均购自云南白药集团中药资源有限公司，经云南中医药大学中药鉴定教研室杨竹雅副教授鉴定为正品[8-9]。制备方法为取等量苍术、艾叶，与藿香、花椒、香薷、佩兰、石菖蒲按2∶1比例混合粉碎后置于圆底烧瓶中，加入8倍蒸馏水浸泡1 h，加热煮沸2 h，提取具有芳香气味的挥发油液体(得率为3.6%)，无水硫酸钠除去挥发油中残留水分，封闭放入4 ℃冰箱中避光保存备用[7]，实验时加入5%吐温-80(美国Sigma公司)助溶液、0.9% NaCl溶液，制成4%稀释液。

1.3 仪器 7.0T磁共振扫描仪(德国Bruker公司)；SNAII Model 1030小动物监护/门控系统(美国Small Animal Instruments公司)；MATRX VIP3000小动物呼吸麻醉机(美国Midmakrk公司)；SA-YLS-8B小动物雾化给药系统(江苏赛昂斯生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 分组与给药 将40只大鼠随机分成4组，每组10只，分别为腹腔注射组、灌胃组、雾化吸入组和对照组。腹腔注射组按0.3 mL/100 g剂量腹腔注射给药，每天1次；灌胃组按0.3 mL/100 g剂量灌胃给药，每天1次；雾化吸入组按雾化给药，每天20 min，各组持续给药14 d。给药结束后，各组均进行心脏磁共振成像扫描。

2.2 心脏磁共振成像扫描 使用7.0T磁共振对各组大鼠进行心脏扫描，选用内径72 mm的鸟笼射频信号发射线圈、56 mm的列阵表面回波信号接收线圈。将大鼠置于密闭的玻璃缸内，并通入氧气与2%异氟烷的混合气体诱导麻醉，迅速转移至磁共振扫描床，使用大鼠专用面罩持续进行吸入麻醉，在大鼠双前肢与右后肢插入心电电极，在腹部放置呼吸感应装置，待心电、呼吸平稳后进床行磁共振扫面，心脏扫描采用梯度回波电影序列(Cine-Flash-flc)，设置参数为重复时间(TR)8.0 ms，回波时间(TE)2.5 ms，反转角(FA)15°，层厚1.5 mm，层间0 mm，每个心动周期电影时相18，视野范围(FOV)50 mm×50 mm，矩阵大小(matrix size)192×192，重复次数(NEX)4，扫描时间(TA)2 min，先进行大鼠胸部定位序列扫描，获得心脏横断位、冠状位、矢状位三个方向上的定位图像，在确定心脏位于发射线圈正中后，参考定位像扫描一层清晰的左室短轴位，再依次扫描出四腔心长轴位与两腔心长轴位，最后在两腔心或四腔心长轴位基础上由心底至心尖扫描连续的左室短轴位。

2.3 图像后处理 将所有扫描后的图像以DICOM格式导入专业心脏后处理软件CVI42(加拿大Circle Cardiovascular Imaging公司)进行分析。心功能分析方法为在软件中Short-3D模块通过添加连续的左室短轴图像，并于舒张末期与收缩末期分别手动勾画出左心室内外膜，获得左心室舒张末期容积(end-diastolic volume,EDV)、左心室收缩末期容积(end-systolic volume,ESV)、每搏输出量(stroke-volume,SV)、射血分数(ejection fraction,EF)等心功能指标，其中乳头肌和左室流出道计算在血池容积与心室容积内；心肌应变分析方法为在Tissue-Tracking模块添加连续的左室短轴图像以及四腔、二腔2个长轴图像后进行心肌分析，在各层舒张末期时相上勾画左心室内外膜，同时手动标记室间隔，并由软件通过自动追踪心肌像素点的运动和位置变化最终获取左心室短轴方向上的整体径向应变(global peak radial strain,GRS)、整体环向应变(global peak circumferential strain,GCS)、整体纵向应变(global peak longitudinal strain,GLS)等二维(two-dimensional,2D)、三维(three-dimensional,3D)心肌应变参数。有学者证实，2D应变参数的重复性高于3D应变参数[14-15]，故本实验仅纳入2D心肌应变参数进行探讨。

2.4 病理学检查 心脏磁共振扫描完成当天，尾静脉注射氯化钾处死大鼠，取出完整心脏，去除心耳，0.9% NaCl溶液冲洗净心腔内剩余血液，将完整心肌组织用甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，常规HE染色，在光学显微镜下观察心肌组织。

3 结果

3.1 组织病理学 各给药组大鼠心肌组织与对照组正常大鼠相似，心肌细胞排列规则，细胞形态结构、细胞质、细胞间质及纵、横纹等均正常，未见坏死、变性、肥大、炎性浸润等任何损伤现象，见图1。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色(×40)Fig.1 HE staining for myocardial tissues of rats in each group (×40)

3.2 苍艾挥发油对大鼠EDV、ESV的影响 不同给药方式之间EDV差异有统计学意义(P<0.05)，其中雾化吸入组高于对照组、灌胃组(P<0.05)，而ESV均无明显变化(P>0.05)，见图2～3。

注：与对照组比较，**P<0.01；与灌胃组比较，#P<0.05。图2 苍艾挥发油对大鼠EDV、ESV的影响Fig.2 Effects of Cang-Ai volatile oils on EDV and ESV in rats

3.3 苍艾挥发油对大鼠SV、EF的影响 与对照组比较，腹腔注射组、雾化吸入组SV升高(P<0.05，P<0.01)，给药组EF均升高(P<0.01)，并且雾化吸入组SV高于灌胃组(P<0.05)，见图4。

3.4 苍艾挥发油对大鼠GRS、GCS、GLS的影响 与对照组比较，腹腔注射组、雾化组GRS、GCS高于对照组(P<0.05)，并且腹腔注射组两者高于灌胃组(P<0.01，P<0.05)，见图5。

注：A～C分别为左室短轴位舒张末期时相、左室长轴位四腔心舒张末期时相、左室长轴位二腔心舒张末期时相。图3 各组大鼠心脏磁共振电影序列图像Fig.3 Images of cardiac magnetic resonance cine sequence of rats in each group

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与灌胃组比较，#P<0.05。图4 苍艾挥发油对大鼠SV、EF的影响Fig.4 Effects of Cang-Ai volatile oils on SV and EF in rats

注：A为16段应变的牛眼图[不同颜色表示应变在-20(蓝/绿过渡)到20(绿/红过渡)之间]，B为苍艾挥发油对大鼠GRS、GCS和GLS的影响。GRS表示心肌向心腔中心的径向增厚与变薄运动，用正值表示；GCS表示心肌沿着圆周方向上的缩短，用负值表示；GLS表示心肌从心底部到心尖的纵向缩短，用负值表示。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与灌胃组比较，#P<0.05，##P<0.01。图5 苍艾挥发油对大鼠GRS、GCS、GLS的影响Fig.5 Effects of Cang-Ai volatile oils on GRS,GCS and GLS in

4 讨论

心血管疾病是目前全球致死人数最多的非传染性疾病之一，心功能受损是其主要表现，也是加速患者死亡的主要原因。本实验首次基于7.0T心脏磁共振评价苍艾挥发油经腹腔注射、灌胃、雾化吸入3种给药途径对正常大鼠的心脏功能的影响，发现该成分能不同程度增强心脏收缩功能。

目前，缺少苍艾挥发油对心血管作用最佳的给药方案，因此本实验对比了3种给药方式对心脏功能的影响，发现腹腔注射、雾化吸入效果更显著，特别是前者，可能是由于在相同的剂量浓度下肠系膜、腹膜的直接吸收较灌胃吸收更快，效率更高，但在病理取材时发现有不同程度的肠系膜、腹膜黏连，推测是长期腹腔注射、药物刺激导致的，需加以关注。另外，雾化吸入与腹腔注射给药对心脏正性肌力作用效果相似，前期报道苍艾挥发油经鼻吸入后心脏是药物的主要靶器官之一，而且肝首过效应低，药物吸收、分布快[16]，该方式单次给药时间与浓度的确立主要依据前期实验基础[9]。因此，对心血管疾病的后续研究，雾化吸入是苍艾挥发油的首选给药方式。

心室容积、压力、SV、EF是评价心功能的重要指标[17-19]，在生理状态下对于心室整体而言，随着EDV增加，心室做功越多，SV就越多，而且EDV可反映心肌纤维收缩的初长度，与心肌收缩力成正相关[20]。本实验发现，苍艾挥发油3种给药方式均可提升大鼠左心室SV、EF、EDV，但对ESV无明显影响。Nakahashi等[21]发现，尼可地尔可增加左心室前负荷，提高正常成年大鼠左心SV、EF、EDV，与本实验结果一致，提示在苍艾挥发油的作用下静脉回心血量增加，心室做功加强，心肌纤维收缩力升高。

左心室的运动是一个复杂的过程，相比EF，通过心肌应变评估其功能具有更高的灵敏度[22]。心肌应变是心动周期过程中心肌纤维在前后负荷作用下收缩、舒张产生的形变，由心肌纤维的舒张末期的初始长度与收缩末期的最大长度决定[23]，本实验发现各给药组大鼠心肌GRS、GCS均较正常大鼠增高，但GLS无明显变化。文献[24-26]报道，正性肌力药物多巴酚丁胺对正常大鼠在药物输入应激态时，可显著提升心肌GCS、GRS、心率、EF与心肌扭转、压力、容积等指标，与本实验结果类似。心肌的环向应变可反映心肌中层环状排列的心肌纤维与心外膜左手螺旋走形的斜行纤维的运动形变，径向应变可反映内、中、外三层心肌纤维的共同运动情况。因此，本实验GCS、GRS的升高提示三层心肌纤维做功增强，这也符合用药后的心室容积变化，心肌纤维在前负荷的作用下收缩运动增强，最终表现出SV、EF升高。

综上所述，苍艾挥发油能增强正常大鼠心脏收缩功能，以雾化吸入给药方式效果更理想，可为研究该成分的心脏保护作用提供依据，也能为后续开展其干预心血管疾病的考察奠定基础。