HPLC法同时测定芩石利咽口服液中8种成分及其镇咳、抗炎活性研究

石美玲，王月洁，胡朝阳，李丽静，鲍慧玮

(长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117)

芩石利咽口服液是由黄芩、生石膏、水牛角、连翘等12味药材组成的合剂，具有清热解毒、疏风利咽等作用，用于急喉痹(急性咽炎)的肺胃实热兼外感风邪证，为治疗急性咽炎的临床常用中成药，但对其药效成分的含量测定鲜有报道，而且原质量标准仅涉及黄芩苷，较为单一，难以全面有效控制其质量。研究表明，芩石利咽口服液中黄芩所含黄芩苷[1]和汉黄芩素[2]、连翘所含连翘酯苷A[3]、赤芍所含芍药苷[4]、皂角刺所含原儿茶酸[5]、紫苏叶所含原儿茶醛[6]、蒲公英所含咖啡酸[7]、薄荷所含木犀草素[8]均具有抗炎作用。因此，本实验采用HPLC法测定芩石利咽口服液中原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、芍药苷、连翘酯苷A、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩素的含量，并评价其镇咳、抗炎活性，以期为该制剂药效物质基础研究及质量标准提高提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 华谱S3000高效液相色谱系统(包括四元低压搅拌泵、自动进样器、柱温箱、ACstation色谱工作站)；HH-2型数显恒温水浴锅(宁波江南仪器厂)；KQ-250型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率250 W，频率40 kHz)；FA1004B型电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；AB135-S型电子分析天平 (十万分之一，梅特勒-托利多国际股份有限公司)；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试剂与药物 芩石利咽口服液(吉林通化金马药业股份有限公司，批号201912020319、202006020001、202002040001、201911010001、202007020001、10 mL/支)；川贝枇杷膏(京都念慈庵总厂有限公司，批号L11705071)；阿司匹林(沈阳奥吉娜药业有限公司，批号170510)。原儿茶酸(纯度98%)、原儿茶醛(纯度98%)、芍药苷(纯度98%)、木犀草素(纯度98%)对照品(南京景竹生物科技有限公司)；汉黄芩素(批号130112)、黄芩苷(批号110715-201117，纯度91.7%)、咖啡酸(批号110885-200102)、连翘酯苷A (批号111810-201606，纯度93.4%)对照品(中国食品药品检定研究院)。甲醇为色谱纯[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；磷酸、氨水为分析纯(北京化工厂)；其他试剂均为分析纯；水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

1.3 动物 成年雄性ICR小鼠，体质量18～22 g，购自长春市亿斯动物技术有限责任公司，动物生产许可证号SCXK(吉)-2020-002，实验前适应性培养7 d。动物实验经长春中医药大学动物实验伦理审查通过(编号2021234)。

2 成分含量测定

2.1 色谱条件 phenomenex色谱柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～8 min，10%A；8～12 min，10%～20%A；12～22 min，20%A；22～30 min，20%～23%A；30～58 min，23%～31%A；58～71 min，31%～44%A；71～91 min，44%～58%A；91～94 min，58%～68%A；94～101 min，68%A；101～111 min，68%～100%A)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长238 nm(芍药苷、黄芩苷)、254 nm(原儿茶酸)、322 nm(原儿茶醛、咖啡酸、连翘酯苷A、木犀草素、汉黄芩素)；进样量20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，制得每1 mL分别含原儿茶醛0.063 9 mg、咖啡酸0.240 2 mg、连翘酯苷A 2.07 mg、木犀草素1.082 mg、汉黄芩素0.273 5 mg、原儿茶酸0.103 4 mg、芍药苷4.563 mg、黄芩苷29.46 mg贮备液，分别精密吸取1 mL，甲醇稀释10倍，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密量取本品5 mL，置于50 mL量瓶中，50%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置于25 mL量瓶中，50%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按处方比例和制备工艺，分别制备缺芍药苷、缺汉黄芩素、缺原儿茶酸、缺原儿茶醛、缺咖啡酸、缺连翘酯苷A、缺木犀草素、缺黄芩苷的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取“2.2.1”项下对照品溶液、“2.2.2”项下供试品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品色谱峰中呈现与对照品保留时间相同的色谱峰，主峰与其相邻峰的分离度均大于1.5，各成分之间互不干扰，杂质峰对各成分也无干扰，表明该方法专属性良好。

1.原儿茶醛 2.咖啡酸 3.连翘酯苷A 4.木犀草素 5.汉黄芩素 6.原儿茶酸 7.芍药苷 8.黄芩苷1.protocatechuic aldehyde 2.caffeic acid 3.phillyrin A 4.luteolin 5.wogonin 6.protocatechuic acid 7.paeoniflorin 8.baicalin图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1 mL，甲醇稀释5倍，得到系列质量浓度，分别吸取20 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得原儿茶醛、咖啡酸、连翘酯苷A、木犀草素、汉黄芩素、原儿茶酸、芍药苷、黄芩苷峰面积RSD分别为1.13%、1.45%、0.98%、0.44%、1.34%、0.71%、1.03%、1.11%，表明仪器精密度良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.4 重复性试验 取本品(批号201912020319)适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得原儿茶醛、咖啡酸、连翘酯苷A、木犀草素、汉黄芩素、原儿茶酸、芍药苷、黄芩苷含量RSD分别为1.77%、1.58%、1.39%、1.80%、1.04%、1.01%、1.24%、1.55%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，室温下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得原儿茶醛、咖啡酸、连翘酯苷A、木犀草素、汉黄芩素、原儿茶酸、芍药苷、黄芩苷峰面积RSD分别为0.48%、0.93%、0.66%、1.05%、0.84%、1.02%、0.92%、0.73%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品6份，每份约2.5 mL，加入对照品溶液0.25 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，原儿茶醛、咖啡酸、连翘酯苷A、木犀草素、汉黄芩素、原儿茶酸、芍药苷、黄芩苷平均加样回收率分别为97.81%、98.56%、98.40%、98.79%、98.75%、98.08%、98.79%、98.67%，RSD分别为1.96%、1.57%、1.36%、1.48%、1.03%、1.45%、1.11%、0.84%。

2.3.7 样品含量测定 取5批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，外标法计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果(μg/mL，n=3)Tab.2 Results of content determination of various constituents(μg/mL,n=3)

3 药理活性研究

本实验采用氨水致小鼠咳嗽模型[9]、二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型[10]、蛋清致小鼠足肿胀模型[11]考察了芩石利咽口服液镇咳、抗炎活性。

3.1 镇咳实验 预实验剔除3 min不发生咳嗽的小鼠，待稳定5 d后，取50只随机分为空白组、川贝枇杷膏组及芩石利咽口服液低、中、高剂量组，连续给药1周，参考文献[12]，设定剂量分别为川贝枇杷膏组0.2 mL，芩石利咽口服液低、中、高剂量组3.9、7.8、15.6 g/kg，空白组给予等体积蒸馏水。于末次给药前12 h小鼠禁食不禁水，给药1 h后置于自制容器中，放入含15%氨水的棉球，记录咳嗽潜伏期(从开始喷雾到第1次咳嗽的时间)和3 min内咳嗽次数(以腹肌收缩或缩胸、同时张大嘴为准，有时会伴有咳嗽声)，结果见图2。由此可知，与空白组比较，芩石利咽口服液中、高剂量组小鼠咳嗽次数减少(P<0.05)，并且各剂量组小鼠咳嗽潜伏期延长(P<0.01)。

注：A～E分别为空白组、川贝枇杷膏组及芩石利咽口服液低、中、高剂量组。与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。图2 芩石利咽口服液对小鼠咳嗽次数(a)、咳嗽潜伏期(b)的影响Fig.2 Effects of Qinshi Liyan Oral Liquid on mouse cough frequency (a) and cough latency (b)

3.2 耳肿胀实验 50只小鼠随机分为5组，连续给药1周，末次给药30 min后在右耳内外两侧均匀涂布二甲苯各20 μL致耳廓肿胀，30 min后沿耳廓基线剪下双耳，用直径6 mm的打孔器在左右两耳同一部位打下耳片，称定质量，计算耳肿胀度、耳肿胀抑制率[13]，公式分别为耳肿胀度=右耳质量-左耳质量、耳肿胀抑制率=[(空白组平均耳肿胀度-给药组平均耳肿胀度)/空白组平均耳肿胀度]×100%，结果见图3。由此可知，与空白组比较，芩石利咽口服液中、高剂量组小鼠耳肿胀度降低(P<0.05)，并且耳肿胀抑制率呈量效关系。

注：A～E分别为空白组、阿司匹林组及芩石利咽口服液低、中、高剂量组。与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。图3 芩石利咽口服液对小鼠耳肿胀度(a)、耳肿胀抑制率(b)的影响Fig.3 Effects of Qinshi Liyan Oral Liquid on mouse ear swelling degree(a) and inhibitory rate of ear swelling(b)

3.3 足肿胀实验 50只小鼠随机分为5组，连续给药7 d，末次给药30 min后，右后足足趾部皮下注射含10%蛋清的生理盐水，1 h后沿脚踝处剪下左右后肢，称定质量，计算足肿胀度[14]、足肿胀抑制率[15]，公式分别为足肿胀度=右足质量-左足质量、足肿胀抑制率=[(空白组足肿胀度-给药组足肿胀度)/空白组足肿胀度]×100%，结果见图4。由此可知，与空白组比较，芩石利咽口服液中、高剂量组小鼠足肿胀程度减轻(P<0.05)，并且足肿胀抑制率呈量效关系。

注：A～E分别为空白组、阿司匹林组及芩石利咽口服液低、中、高剂量组。与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01。图4 芩石利咽口服液对小鼠足肿胀度(a)、足肿胀抑制率(b)的影响Fig.4 Effects of Qinshi Liyan Oral Liquid on mouse foot swelling degree (a) and inhibitory rate of foot swelling (b)

4 讨论

本实验分别考察了色谱柱、流动相、检测波长、柱温，发现Phenomenex C18柱更适用于芩石利咽口服液的分析；甲醇-0.1%磷酸为流动相时，色谱峰分离效果较好，分离度较高；多波长切换检测时，具有良好的吸收，既提高效率又节约成本；柱温为30 ℃时，柱效较高，峰对称性较好，各色谱峰之间实现基线分离。

文献[16-17]报道，黄芩中黄酮类化合物具有显著的抗炎作用，并在呼吸道炎症等多种疾病模型中验证；芍药苷为赤芍发挥抗炎作用的主要成分，能降低炎症细胞因子和足肿胀[18-19]；连翘酯苷A为连翘药效成分，对二甲苯所致小鼠耳部炎症显示出较强的抗炎活性[20]；原儿茶酸、原儿茶醛是急支糖浆中发挥抗炎作用的药效成分[21]，临床上用于质量咳嗽痰多的复方四季青片也选用两者作为检测指标[22]；咖啡酸广泛用于治疗炎症[23]；木犀草素已被证明在多种细胞和动物模型中表现出显著的抗炎活性[24]。药理结果表明，芩石利咽口服液可减少小鼠咳嗽次数，延长咳嗽潜伏期，并对二甲苯致小鼠耳肿胀和蛋清致小鼠足肿胀有一定抑制作用，可能与所测8种成分相关。

5 结论

本实验建立HPLC法同时测定芩石利咽口服液中原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、芍药苷、连翘酯苷A、黄芩苷、木犀草素、汉黄芩素的含量，并评价其镇咳、抗炎活性，可为进一步完善该制剂质量标准及有效控制其质量提供参考，也能为相关临床治疗提供理论依据。