松萝酸纳米混悬剂制备及其体内药动学研究

房 伟，王奎鹏，韩德恩

(1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；2.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450006)

松萝酸主要分布于松萝、石蕊衣、黄花岛等地衣植物中，资源丰富[1]，具有抗病毒、抗炎、抗氧化、麻痹镇痛、抗肿瘤等活性[1-3]，但该成分水溶性和脂溶性均较差[4]，不利于药物溶解溶出及胃肠道透膜吸收，而且在体内容易受到各种酶的代谢作用[5]，从而影响其口服生物利用度[4,6]。目前，对松萝酸已有脂微球[7]、自微乳[8]等制剂学研究，但处方组成及制备工艺较复杂；宋婷等[4]对该成分磷脂复合物及口服药动学进行了研究，但其黏性较大，不利于药物溶出，并且其口服生物利用度提高程度在109.67%～177.83%之间，具有较大的改善空间。

纳米混悬剂是通过稳定剂在某种制剂技术作用下，将难溶性药物制成胶态药物分散体系[9-10]，可提高药物溶解度、溶出度、生物利用度，而且制备工艺简单。因此，本实验采用高压均质法制备松萝酸纳米混悬剂，并考察其体内药动学，以期为相关制剂学研究提供参考。

1 材料

EX125DZH型电子分析天平(美国奥豪斯公司)；Mastersizer-300型粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)；安捷伦1200型高效液相色谱仪(OpenLAB CDS工作站，美国安捷伦公司)；MYP13-2S型磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；ATS型均质机(加拿大Seeker公司)；LTB-800型超声仪(济宁鲁通超声电子设备有限公司)；MDF-86V588D型超低温冰箱(中科都菱设备有限公司)；H-600型透射电镜(日本电子公司)。

松萝酸对照品(批号190915，纯度98.9%，盛世康普化工技术研究院)；松萝酸原料药(批号20191023，纯度97%，南京天诺新材料有限公司)。聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30，批号191207，亚什兰集团公司)；聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS，批号20201005，西安海斯夫有限公司)；大豆卵磷脂(批号190617，辅必成科技有限公司)；吐温80(F1901016，上海雷允上药业有限公司)；乳糖(批号D2101115，阿拉丁控股集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定松萝酸含量

2.1.1 色谱条件 参考文献[5]报道，Welchrom C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相甲醇-[50 mmol/L KH2PO4-三乙胺(500∶1，超声混匀)](70∶30)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长285 nm。

2.1.2 线性关系考察 称取松萝酸对照品10 mg至量瓶中，加入5 mL三氯甲烷超声溶解，甲醇定容至50 mL，得200 μg/mL贮备液，甲醇制成10、5、1、0.5、0.1、0.02 μg/mL溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以松萝酸质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=13.159 3X-0.813 5(r=0.999 8)，在0.02～10 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液制备 取0.5 mL纳米混悬剂至100 mL量瓶中，加入80 mL甲醇超声溶解，室温静置30 min后定容，即得。

2.1.4 方法学考察 取供试品溶液适量，于0、3、6、12、18、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得松萝酸峰面积RSD为0.46%，表明溶液稳定性良好。取同一份纳米混悬剂，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得松萝酸峰面积RSD为1.70%，表明该方法重复性良好。取10、1、0.02 μg/mL对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下各进样测定6次，测得松萝酸峰面积RSD分别为0.31%、0.25%、0.54%，表明仪器精密度良好。取0.25 mL供试品溶液至100 mL量瓶中，加入对照品溶液1.0 mL(低)、1.25 mL(中)和1.5 mL(高)，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得平均加样回收率分别为99.07%、100.78%、100.26%，RSD分别为1.46%、1.02%、0.85%。

2.2 纳米混悬剂制备 采用高压均质法[10]。取松萝酸50 mg、大豆磷脂100 mg，加入10 mL丙酮，在50 ℃水浴下磁力搅拌2 h至溶液澄清，加到50 mL含有其他稳定剂的溶液中，减压旋蒸除去有机溶剂，补充蒸馏水至50 mL，在一定压力下循环均质数次，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3 粒径、PDI、Zeta电位的测定 取纳米混悬剂0.2 mL，加入20 mL蒸馏水稀释，混匀，取约3 mL至比色皿中，在粒度分析仪上测定粒径、PDI、Zeta电位。

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2.4 单因素试验优化制备工艺

2.4.1 稳定剂种类 固定松萝酸用量50 mg，大豆磷脂用量100 mg，均质压力70 MPa，均质次数10次，考察PVP K30、泊洛沙姆188、吐温80、TPGS(用量均为100 mg)对粒径、PDI、Zeta电位的影响，结果见表1。由此可知，仅泊洛沙姆188所制备纳米混悬剂的Zeta电位绝对值超过30 mV，而且粒径、PDI最低，故选择其作为稳定剂。

表1 稳定剂种类对粒径、PDI、Zeta电位的影响(n=3)Tab.1 Effects of stabilizer type on particle size,PDI and Zeta potential (n=3)

2.4.2 稳定剂用量 固定松萝酸用量50 mg，大豆磷脂用量100 mg，均质压力70 MPa，均质次数10次，考察泊洛沙姆188用量60、80、100、120 mg对粒径、PDI、Zeta电位的影响，结果见表2。由此可知，不同用量所制备纳米混悬剂的PDI均小于0.3，表明纳米粒分布较为集中。当用量较小时，乳化能力可能不足而导致粒径稍大，但用量较大时粒径反而有所上升，可能是黏度增加所致；用量为100 mg时粒径较小，PDI最小，Zeta电位绝对值大于30 mV，故选择其作为稳定剂用量。

表2 稳定剂用量对粒径、PDI、Zeta电位的影响(n=3)Tab.2 Effects of stabilizer consumption on particle size,PDI and Zeta potential (n=3)

2.4.3 均质压力 固定松萝酸用量50 mg，大豆磷脂用量100 mg，稳定剂用量100 mg，均质次数10次，考察均质压力50、60、70、80、90 MPa对粒径、PDI、Zeta电位的影响，结果见表3。由此可知，随着均质压力增加，粒径有所下降，但在90 MPa时反而上升，并且PDI增加，可能是由于过大的均质压力会使纳米体系温度升高，导致纳米粒子之间发生聚集甚至融合，从而粒径增大，分布不均匀，故选择80 MPa作为均质压力。

表3 均质压力对粒径、PDI、Zeta电位的影响(n=3)Tab.3 Effects of homogenization pressure on particle size,PDI and Zeta potential (n=3)

2.4.4 均质次数 固定松萝酸用量50 mg，大豆磷脂用量100 mg，稳定剂用量100 mg，均质压力80 MPa，考察均质次数6、8、10、12、15次对粒径、PDI、Zeta电位的影响，结果见表4。由此可知，随着均质次数增加，粒径逐渐下降，但在15次时粒径、PDI均有升高趋势，Zeta电位绝对值有下降趋势，故选择12次作为均质次数。

2.5 验证试验 单因素试验结果显示，最优制备工艺为稳定剂(泊洛沙姆188)用量100 mg，均质压力80 MPa，均质次数12次。按上述优化工艺平行制备3批纳米混悬剂，测定粒径、PDI、Zeta电位，结果见图1～2。由此可知，平均粒径为185.19 nm，PDI为0.089，Zeta电位为-34.08 mV，表明该工艺重复性较好。

图1 纳米混悬剂粒径分布Fig.1 Particle size distribution of nanosuspensions

图2 纳米混悬剂Zeta电位Fig.2 Zeta potential of nanosuspensions

2.6 形态观察 取适量纳米混悬剂，蒸馏水稀释50倍后滴至铜网上，1.5%磷钨酸钠负染，滤纸吸除多余液体，室温晾干后在透射电镜下进行观察。由图3A可知，纳米混悬剂呈球形或类球形，纳米粒之间无粘连。

图3 样品透射电镜图Fig.3 Transmission electron microscopic images for samples

2.7 冻干粉制备及溶解度测定 取纳米混悬剂适量，加入6%甘露醇并混匀，置于-50 ℃冰箱中预冻2 d后转到-20 ℃真空冻干机中2 d，即得冻干粉(图4)，密封后于干燥器中保存。取适量，蒸馏水复溶后测得其平均粒径增加至231.42 nm，Zeta电位为-30.37 mV。

图4 纳米混悬剂冻干粉外观Fig.4 Appearance of lyophilized powder of nanosuspensions

再采用饱和溶剂法测定溶解度。取过量松萝酸、纳米混悬剂、物理混合物(比例同纳米混悬剂)，置于蒸馏水中，平行3份，分别超声处理20 min至松萝酸不再溶解，置于25 ℃水浴中持续磁力搅拌2 d，取上层混悬液，6 500 r/min离心20 min，HPLC法测定上清液中松萝酸含量。结果，原料药在水中的溶解度为6.86 μg/mL，而纳米混悬剂为92.47 μg/mL，提高了13.48倍，另外物理混合物中其溶解度为12.62 μg/mL，可能是处方中表面活性剂的增溶作用所致，但提高程度远低于纳米混悬剂。

2.8 体外释药研究 取松萝酸、纳米混悬剂、物理混合物(比例同纳米混悬剂)适量(以松萝酸计均为15 mg)，用超声脱气后的1%SDS溶液制成混悬液，并转移至活化透析袋中(截留分子量8 000～14 000 Da)，以900 mL 1%SDS溶液为介质，设定溶出仪(配置自动取样器)温度为37 ℃，转速为100 r/min，于设定时间点各取样4 mL，并补充4 mL空白介质，6 500 r/min离心20 min，HPLC法测定上清液中松萝酸含量，绘制溶出曲线，见图5。由此可知，纳米混悬剂在60 min内累积溶出度达90.46%，90 min内基本溶出完全，但松萝酸在120 min内也仅为19.93%，另外物理混合物在一定程度上也增加了松萝酸溶出度，但程度远低于纳米混悬剂。

图5 松萝酸体外释药曲线(n=3)Fig.5 In vitro drug release curves for usnic acid (n=3)

2.9 药动学研究

2.9.1 分组、给药与采血 12只大鼠随机分为松萝酸组、纳米混悬剂组，每组6只，按15 mg/kg剂量灌胃给予相应药物的0.5%CMC-Na混悬液(以松萝酸计均为2.5 mg/mL)，0.5 mL饮用水冲洗灌胃针后再次灌胃给药，于0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、10、12 h眼眶后静脉丛采血各约0.2 mL，血样肝素化后立即3 500 r/min离心3 min，取上层血浆，置于-15 ℃冰箱中保存。另取6只大鼠，设置物理混合物组，同法灌胃给药。

2.9.2 血浆处理 参考文献[5]报道的方法，取含药血浆100 μL至离心管中，加入200 μL磷酸盐缓冲液(pH=7.4)，密封后涡旋30 s，加入1 mL甲醇涡旋3 min，12 000 r/min离心10 min，分离上清液至另一离心管中，氮气缓慢吹干得残渣。加入100 μL甲醇后密封，涡旋30 s，进样测定。

2.9.3 方法学考察 取空白血浆适量，制成8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.1 μg/mL血浆对照品溶液，各取0.5 mL，按“2.9.2”项下方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积(Y)对松萝酸质量浓度(X)进行回归，得方程为Y=348.21X+50.11(r=0.992 9)，在0.1～8.0 μg/mL范围内线性关系良好。

取空白血浆、含药血浆(纳米混悬剂给药12 h后)、0.1 μg/mL血浆对照品溶液适量，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，结果见图6，可知血浆内源性杂质未对测定产生干扰，表明该方法专属性良好。取8.0、2.0、0.1 μg/mL血浆对照品溶液，同一天内在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得松萝酸峰面积RSD分别为3.15%、4.62%、4.19%，表明该方法日内精密度良好；同法于第1、2、3、4、5、6天各进样测定1次，测得松萝酸峰面积RSD分别为6.34%、8.17%、7.42%，表明该方法日间精密度良好。取含药血浆适量，室温下于0、2、4、6、12、24 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得松萝酸峰面积RSD为7.53%，表明血浆在24 h内稳定性良好。取8.0、2.0、0.1 μg/mL血浆对照品溶液适量，在“2.1.1”项色谱条件下各进样测定3次，测得松萝酸平均加样回收率分别为90.42%、93.67%、87.07%。

1.松萝酸1.usnic acid图6 松萝酸HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of usnic acid

2.9.4 结果分析 绘制血药浓度-时间曲线，采用3P97程序统计矩模型计算主要药动学参数，结果见图7、表5。由此可知，与原料药、物理混合物比较，纳米混悬剂tmax缩短(P<0.01)，t1/2延长(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相对生物利用度提高至3.09倍；物理混合物主要药动学参数与原料药比较有一定改变，可能与处方中稳定剂增溶作用有关，但差异均无统计学意义(P>0.05)。

图7 松萝酸血药浓度-时间曲线(n=6)Fig.7 Plasma concentration-time curves for usnic acid (n=6)

3 讨论

本实验所用的泊洛沙姆188作为稳定剂，可提供较大的空间阻力，防止纳米混悬剂聚集[11-12]。另外，磷脂一方面发挥增溶作用，使药物形成均一溶液；另一方面可向纳米粒子提供电荷，从而增加了纳米粒子之间的排斥作用[13]，提高了制剂的稳定性，与泊洛沙姆188共同发挥了稳定剂的作用。

表5 松萝酸主要药动学参数Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for usnic acid

结果显示，松萝酸制成纳米混悬剂后溶解度、溶出度均大幅度提高，主要与该成分比表面积明显增加、稳定剂增溶作用等因素有关；纳米混悬剂tmax显著缩短，可能与该制剂促进药物溶出、提高药物前期溶出速率有关；文献[10,14]报道，纳米混悬剂可显著延长药物t1/2，可能是由于胃肠道环境较为复杂，影响因素较多，药物在胃肠道内完全溶出溶解需要一定时间，从而影响进入血液循环的时间所致，并且纳米药物能增加与胃肠道黏膜的粘附性，可能也会对上述药动学参数造成影响[14]；口服生物利用度显著提高，这是因为将该成分纳米化后增加了其溶解度，促进了溶出。

研究表明，纳米混悬剂由于具有较小的粒径，可增加跨膜渗透性[9,15]；稳定剂吸附于纳米药物表面，可降低胃肠道各种酶对药物稳定性的影响[9]；纳米药物在伊派尔结中聚集[14-17]，通过淋巴结中的M细胞进入体循环，从而改变吸收途径。另外，纳米混悬剂口服进入胃肠道后可能发生聚集，导致粒径变大，从而影响生物利用度提高程度。今后，本实验将对松萝酸纳米混悬剂的药效学开展研究[18]，以期为该制剂开发提供更全面的资料。