UPLC-ESI-Q-TOF MS结合裂解规律分析姜科植物中二苯基庚烷类成分

胡雪雨，王彦志，2*，宋志敏，刘煜飞，刘双晶，冯卫生*

（1.河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450046；2.呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南 郑州 450046）

二苯基庚烷是一类具有1，7-二取代苯基并以庚烷骨架为母体结构的化合物，可分为线性二苯基庚烷类和环状二苯基庚烷类化合物［1］。其主要药理活性有抗氧化、抗炎、抗病毒、细胞毒性、抗菌等［2-8］，主要存在于姜科植物（如生姜、高良姜、草豆蔻、草果、益智仁）中，是大多数姜科植物的主要活性成分［9-11］。姜皮，别名生姜衣，为姜科植物姜（Zingiber officinaleRosc.）的干燥根茎外皮［12］，在秋季挖取姜的根茎后洗净并刮取外皮晒干即得，现行中国药典尚未收载，但部分地方中药饮片有收载［13］。姜皮味辛性凉，归于脾、肺经，可起到发汗解表和行水消肿等作用［1］。草果，味辛性温、无毒，为姜科豆蔻属植物草果（Amomum tsao-ko）的干燥成熟果实［14］，具有燥湿健脾、祛痰截疟之功效，主治痰饮胸满、心腹疼痛、脾虚泄泻、疟疾等证［15］。益智仁是姜科山姜属植物益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）的干燥成熟果实［16］，是“四大南药”之一［17］，性温，归脾、肾经，可暖肾固精缩尿、温脾止泻摄唾［18］。目前，关于二苯基庚烷类化合物的研究多集中于姜和高良姜［19-20］，由于缺少标准品，只能依据质谱推测的化合物结构，推断此类成分的质谱裂解规律，故缺乏足够的准确性。

本研究采用具有高分辨率和高准确性的电喷雾-四极杆-飞行时间质谱（ESI-Q-TOF MS），对11 个不同类型二苯基庚烷类化合物标准品的电喷雾质谱碎片离子进行全面解析，推测可能的裂解途径，总结二苯基庚烷类化合物的裂解规律，完善了此类化合物的质谱鉴定方法。并根据裂解途径，采用超高效液相色谱-电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱（UPLC-ESI-Q-TOF MS）对姜科植物来源中药姜皮、草果、益智仁中的二苯基庚烷类成分进行鉴定。

1 实验部分

1.1 主要仪器

UPLC-Triple TOF 6600 型超高效液相色谱-电喷雾-飞行时间高分辨质谱仪（美国AB SCIEX 公司）；BSA224S 型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；5424R 型低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 材料与试剂

（3R，5S）3，5-二羟基-1-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-7-（3，4-二羟基苯基）庚烷（标准品1）、（3R，5R）3-乙酰氧基-5-羟基-1-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-7-（3，4-二羟基苯基）庚烷（标准品2）、（3R，5S）3，5-二羟基-1-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）庚烷（标准品3）、（3R，5R）3-乙酰氧基-5-羟基-1-（4-羟基-3，5-二甲氧基苯基）-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）庚烷（标准品4）、3，5-二乙酰氧基-1，7-双（3，4-二羟基苯基）庚烷（标准品5）、3，5-二羟基-1，7-双（4-羟基-3，5-二甲氧基苯基）庚烷（标准品6）、（3R）3-羟基-1，7-双（3，4-二羟基苯基）庚烷（标准品7）、1，7-双（4-羟基-3-甲氧基苯基）-5-甲氧基-3-庚酮（标准品8）、（1S，5S，3R）1，5-环氧-3-羟基-1-（4，5-二羟基-3-甲氧基苯基）-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）庚烷（标准品9）、（1S，5S，3S）1，5-环氧-3-羟基-1-（4，5-二羟基-3-甲氧基苯基）-7-（4，3-二羟基苯基）庚烷（标准品10）、（1S，5S，3R）1，5-环氧-3-羟基-1-（4-羟基-3，5-二甲氧基苯基）-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）庚烷（标准品11）（纯度＞95%）。11 个标准品对应的4 种二苯基庚烷结构类型示于图1，各化合物的结构信息示于表1。甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）。实验用水为蒸馏水（中国屈臣氏公司）。

表1 11种二苯基庚烷的化学结构Table 1 Chemical structures of diarylheptanoids

图1 4种二苯基庚烷的结构骨架类型Fig.1 Structural skeleton types of 4 diarylheptanoids skeleton R1-R8 were shown in Table 1

姜皮、草果购于云南省曲靖市红河县，益智仁购自海南省琼中市，经河南中医药大学陈随清教授鉴定分别为姜科植物姜Zingiber officinaleRosc. 的根茎外皮，以及姜科植物草果Amomum tsaokoCrevost et Lemarie 和益智Alpinia oxyphyllaMiq. 的干燥成熟果实。

1.3 色谱分析条件

色谱柱：Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，1.7µm），柱温：40 ℃，流速：0.3 mL·min-1，进样量：2 µL，流动相：A 为0.1%甲酸水溶液，B 为乙腈。姜皮成分的洗脱梯度：0～2.0 min，5% B；2.0～4.0 min，5%～15%B；4.0～24 min，15%～70%B；24～25 min，70%～90%B；25～27 min，90%B；27～28.1 min，90%～5% B；28.1～30 min，5% B。草果和益智仁成分的洗脱梯度：0～2.0 min，5% B；2.0～4.0 min，5%～40% B；4.0～23 min，40%～90% B；23～27 min，90% B；27～28 min，90%～5%B；28～30 min，5%B。

1.4 质谱分析条件

ESI 电离源，正离子扫描，喷雾气：310 264 Pa（45 psi），辅助加热气：344 738 Pa（50 psi），气帘气：241 316 Pa（35 psi），去簇电压：80 V，源温度：550 ℃，一级质谱扫描范围：m/z100～1 000，二级质谱扫描范围：m/z50～1 000，碰撞电压：（40±20）V。

标准品采用针泵注射获得质谱数据，注射泵进样速度：10µL/min。

1.5 样品处理

1.5.1 标准品制备 分别精密称取各标准品1 mg于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，过0.22µm微孔滤膜，备用。

1.5.2 供试品制备 姜皮用10 倍量50%乙醇加热回流提取2 次，每次2 h，滤除药渣后将提取液浓缩干燥得浸膏。用适量50%甲醇溶解，过0.22µm 微孔滤膜，离心（12 000 r/min，15 min），取上清液备用。草果和益智仁分别用10倍量75%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，滤除药渣后将提取液浓缩，再用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩干燥得浸膏，用适量70%甲醇水溶液溶解，过0.22µm 微孔滤膜，离心（12 000 r/min，15 min），取上清液备用。

实验前，分别使用对应的校正液对正离子模式进行校正。使用进样针分别吸取约200µL 标准溶液，在正离子模式下进样分析。

2 结果与讨论

2.1 正离子模式下二苯基庚烷类化合物的裂解规律

在正离子模式下，本实验能够得到各化合物清晰的二级质谱图，及其质谱信息（表2）。各标准品的精确质荷比与理论质荷比相吻合，质谱碎片信息全面、稳定。

表2 11个二苯基庚烷的质谱信息Table 2 Mass spectrometric informations of diarylheptanoids

2.1.1 Ⅰ类二苯基庚烷类化合物的裂解规律 根据Ⅰ类二苯基庚烷类化合物标准品的碎片特征综合推断，此类化合物主要有两条裂解途径。

图2A 为标准品4的二级质谱图，由图推测，化合物首先丢失碳链上的取代基—OH、—OCOCH3产生碎片m/z371，一条裂解途径是C7位上的苯环及其取代基丢失，产生碎片m/z247，然后从C7到C2依次丢失1 个C，产生碎片m/z233、m/z221、m/z207，以及主要特征碎片m/z193、m/z167。另一条裂解途径是C1位上的苯环及其取代基丢失，产生碎片m/z217，然后丢失CH2，产生碎片m/z203，随后分别丢失C2H4、CH2，依次产生碎片m/z175、m/z161；m/z203还可丢失C2H2产生碎片m/z177，碎片m/z177丢失1 个CH2或C3H4，分别产生碎片m/z163 和主要特征碎片m/z137，碎片m/z163 脱水，产生碎片m/z145，随后丢失1 个CH2，产生碎片m/z131。标准品4 可能的裂解途径见图3。通过对标准品1、2、3、5、6的二级碎片离子进行全面解析，推测其裂解途径与标准品4基本一致。

图2 二苯基庚烷标准品（4、7、8、10）的二级质谱图Fig.2 ESI-MS/MS spectra of diarylheptanoid standards（4，7，8，10）A. standard 4；B. standard 7；C. standard 8；D. standard 10

2.1.2 Ⅱ类二苯基庚烷类化合物的裂解规律 Ⅱ类二苯基庚烷类化合物的裂解途径与Ⅰ类相似，差别在于，碳链在裂解过程中只出现1 个双键(2 个苯环都丢失的情况除外)。根据标准品7 的二级质谱图(图2B)推测，在正离子模式下，化合物首先丢失碳链上的取代基—OH，产生碎片m/z315，然后丢失C6H6O2产生碎片m/z205，进一步丢失C3H6产生碎片m/z163，进而丢失CH2产生碎片m/z149，碎片m/z149 丢失C2H2形成主要特征碎片m/z123，或者脱水形成碎片m/z131，碎片m/z163还可脱水形成碎片m/z145，然后丢失CH2形成碎片m/z131。其可能的裂解途径见图4。

图4 标准品7可能的裂解途径Fig.4 Proposed fragmentation pathways of standard 7

2.1.3 Ⅲ类二苯基庚烷类化合物的裂解规律 通过对Ⅲ类标准品的质谱数据进行分析，推测该类化合物主要有两条裂解途径。根据标准品8的二级质谱图（图2C）推测，一条裂解途径是C3—C4键断裂产生碎片m/z179，进一步丢失O，产生碎片m/z163，随后丢失C2H2，产生主要特征碎片m/z137。另一条途径是C2—C3键断裂，产生碎片m/z207，进一步丢失CH2O产生碎片m/z177，然后丢失C3H4，产生主要特征碎片m/z137，碎片m/z177还可丢失CH4O产生碎片m/z145，进一步丢失CH2产生碎片m/z131。其可能的裂解途径见图5。

图5 标准品8可能的裂解途径Fig.5 Proposed fragmentation pathways of standard 8

2.1.4 Ⅳ类二苯基庚烷类化合物的裂解规律 不同于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类线性二苯基庚烷，Ⅳ类二苯基庚烷是环状二苯基庚烷。

根据标准品10的二级质谱图（图2D），推测该类化合物有两条裂解途径，一条途径是C5—C6键断裂，产生碎片m/z237，再丢失CH2产生碎片m/z223，进一步丢失C2H4O产生主要特征碎片m/z179，碎片m/z179分别丢失C2H2、CH4O，产生主要特征碎片m/z153和m/z147，其中m/z147可丢失CO产生碎片m/z119。另一条途径是含氧环断裂产生碎片m/z165，然后丢失C2H2O产生主要特征碎片m/z123。通过对标准品9、11的二级碎片离子进行综合分析，推测其裂解途径与标准品10基本一致。标准品10可能的裂解途径见图6。

图6 标准品10可能的裂解途径Fig.6 Proposed fragmentation pathways of standard 10

2.2 3种姜科植物中二苯基庚烷类化合物的鉴定

利用UPLC-ESI-Q-TOF MS 获得姜皮、草果、益智仁的质谱信息，结合裂解规律，分别鉴定出14、11、10个二苯基庚烷类化合物（见表3），其详细鉴定过程以化合物9、11为例进行阐述。

表3 二苯基庚烷的鉴定结果Table 3 Identification results of diarylheptanoids

（续表3）

化合物9的［M+H］+为m/z405.191 1，元素组成分析显示其分子式为C22H28O7。其二级质谱图与标准品9相似，推测为Ⅳ类二苯基庚烷类化合物，特征碎片离子m/z193.086 0、m/z167.070 2与标准品9的m/z179.071 0、m/z153.054 9相比分别增加14.015 0、14.015 3，结合裂解规律以及文献［21］推测化合物9为1，5-环氧-3-羟基-1-（4-羟基-3，5-二甲氧基苯基）-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）庚烷。

化合物11 的［M+H］+为m/z435.201 2，分子式为C23H30O8。其二级质谱图与标准品4 相似，推测为Ⅰ类二苯基庚烷类化合物，特征碎片离子m/z179.069 8、m/z153.054 5 与标准品4 的m/z193.086 6、m/z167.071 0 相比分别减少14.016 8、14.016 5，结合裂解规律以及文献［22］推测化合物11 为3-乙酰氧基-5-羟基-1-（3-甲氧基-5，4-二羟基苯基）-7-（3-甲氧基4-羟基苯基）庚烷。

在3 类药材中，检出最多的二苯基庚烷类型是Ⅰ类，其次是Ⅳ类。姜皮和草果中Ⅰ类的二苯基庚

烷较多，而益智仁中Ⅲ类的二苯基庚烷相对较多。由峰面积比（Area ratio=化合物峰面积/各自药材中的1，5-环氧-3-羟基-1-（3，4-二羟基-5-甲氧基苯基）-7-（4-羟基苯基）庚烷的峰面积×100%）可看出，Ⅲ类二苯基庚烷的响应值在3种药材中普遍较高。

3 结 论

本文采用ESI-Q-TOF MS 对11 种二苯基庚烷类化合物标准品的质谱裂解规律进行研究，发现各类二苯基庚烷在正离子模式下主要有两种裂解途径，C1或C7与苯环及其取代基会形成主要特征碎片，根据质谱图的主要碎片峰推测苯环上的取代基，比如m/z107、m/z123、m/z137、m/z153、m/z167 分别提示苯环上的取代基为1 个羟基、2 个羟基、1 个羟基和1 个甲氧基、2 个羟基和1 个甲氧基、1 个羟基和2 个甲氧基。对于线性二苯基庚烷（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类），若碳链上无羰基，在正离子模式下首先丢失碳链上的取代基，随后主要有两条裂解途径，一条是C7位上的苯环丢失，然后从C7到C2依次丢失；另一条是C1位上的苯环丢失，然后从C1到C6依次丢失，但当苯环上有2 个及以上取代基时，可能会出现更多的裂解途径。若碳链上有羰基，由于羰基的存在，这类二苯基庚烷多为羰基左右的碳键发生断裂，由此产生2 条主要裂解途径，首先丢失O，然后依次丢失其他基团。对于环状二苯基庚烷（Ⅳ类），含氧环附近发生碳键裂解，产生2 条主要裂解途径，此外，该类二苯基庚烷除了C1或C7与苯环及其取代基会形成主要特征碎片外，还会出现C1～C3与苯环及其取代基所形成的主要特征碎片，如m/z179。依据本研究总结的二苯基庚烷类化合物的质谱裂解规律，从姜皮、草果、益智仁中分别鉴定出14、11、10 个二苯基庚烷类成分，为姜科植物中该类化合物的快速定性分析提供了理论基础。