微纳米尺度生物体温度测量方法及展望

王 政, 欧阳可琛, 邢 力, 冯晓娟, 张金涛

(1. 清华大学 精密仪器系,北京 100084； 2. 中国计量科学研究院 热工计量科学研究所,北京 100029；3. 清华大学 核能与新能源技术研究院,北京 100084)

1 引 言

细胞是生物体最基本的结构和功能单元,其新陈代谢活动产生热量[1],造成温度的改变,同时,不同温度环境也影响细胞的生命演变过程。因此,细胞、生物体的温度及其分布,是物理表征生物体和细胞的生命活动能力的重要参数。温度变化可用于改变细胞的活动特性,比如对癌变细胞的温度进行控制,可抑制癌细胞活性甚至诱导死亡[2]；温度还可以用来观测递送药物后靶细胞的动态变化及内部的交互变化,更有利于筛选药物和精准标靶,减少对正常细胞组织的损伤[3]。

由于细胞体积较小,一般约在10～100 μm之间,内部存在复杂的亚结构,与外界环境具有多自由度的交互作用,因此细胞的温度测量,有生物友好、抗干扰、高时空分辨率、高实时性等要求[4]。近年来,随着对凝聚态物理现象的深入了解和纳米制备技术的进步,测量生物体和细胞温度的传感技术也获得了迅速的发展。

鉴于目前细胞测温技术的发展存在传感器种类繁杂,测温原理、使用特性和计量性能差异明显等问题,本文从测温技术特点和计量性能两个方面,对近十几年来,应用于生物体和细胞测温的微纳热电偶、热电阻、红外热像仪、磁性纳米粒子和荧光发光等方法进行了比较分析,并梳理各种测温方法的优缺点及研究现状,最后针对金刚石纳米粒子应用于生物体和细胞的测温方法进行了展望。

2 生物细胞测温技术发展现状

按测温依据的不同效应，本文将细胞测温方法分为热电、热辐射、热磁、荧光以及复合5类,见表1。

表1 微纳米尺度生物体测温技术汇总Tab.1 Summary of the technology of micro-nano meter scale biosome temperature measurement

表1中概括了生物体(细胞)代表性测温技术的原理、方法、测温特点、研究对象和发展现状。除红外测温外,其他测量技术均为接触式测量,其中热电类方法传输电信号,一般需要引线,热磁和荧光类方法传输磁或光信号,对于微观测量具有一定优势；荧光类测量在测温精度与易实现等方面均存在优势,因此近几年成为了细胞内测温的研究热点和主要技术手段。

3 代表性生物细胞测温方法

3.1 热电效应测温

3.1.1 微纳热电偶

热电偶是一种广泛使用的温度传感器,两种不同材料的金属丝在两端形成结点,一端为参考温度另一端为被测温度。当被测温度不同于参考点温度时,塞贝克效应会因为两种丝材传输电子性质的差异,在探测点和参考点之间形成(热)电势,该电势与温度有单值对应关系,且在较宽温度范围内保持恒定和近似线性,从而可获得探测点的温度。

为了能够将热电偶测温技术用于细胞尺度的测量,需采用现代的微加工技术,将宏观尺度的传统热电偶制作为微尺度的热电偶传感器。2005年Watanab等[5]在玻璃微量吸液管表面沉积金属镍(Ni)和具有高电阻率的类金刚石(DLC)膜,利用聚焦离子束(FIB)刻蚀尖端(直径1 μm)进行微加工切断,通过离子溅射在DLC膜上沉积一层50 nm的康铜合金薄膜,在切口处与镍膜接触,最后在合金薄膜外沉积DLC膜,从而形成微纳尺度的热电偶探针,其测温系统见图1。利用该方法制备的金属铂(Pt)和金(Au)微纳热电偶探针,热电势为2.1 μV/K,测温灵敏度优于常规热电偶1个数量级。

图1 微纳热电偶测温系统示意图[5]Fig.1 Schematic diagram of micro-thermocouple measurement system[5]

2006年Haeberle等[6]在原子力显微镜(AFM)的导电悬臂梁上,使用焦耳加热的电阻器,在0.5 μm长的硅尖端上,刻蚀出了半径为5～10 nm的热电偶探针,热电势为(1.26±0.06) μV/K,可获得优于100 nm的空间分辨率和10 mK的温度分辨率。

2010年Shrestha等[7]在玻璃微移液管表面进行点焊锡合金,通过物理气相沉积(PVD)在移液管外表面涂上金属薄膜(Ni+Au)制成微纳热电偶传感器,热电势达到8.45～8.86 μV/K,比文献[6]的热电偶探针提高了近4倍。同年, Sadat等[8]在AFM的硅(Si)悬臂梁的固定端和自由端分别沉积钛粘附层和铂(Pt),通过探针对金薄膜上点接触区域(直径约10 nm)的热电电压进行测温；该方法还可实现纳米尺度温度梯度的测量,其空间分辨率可达100 nm。

2011年Wang[9]设计制造了一种钨(W)探针为衬底,聚氨酯(PU)为绝缘层,外部由一层均匀的铂金属(Pt)附着的微纳热电偶,探针尺度为50 nm和100 nm,其中100 nm尺度的探针热电势受环境的影响小,热电偶探针的热平衡响应时间短,计算机模拟显示,探针与被测细胞接触400 ns后,温度达到一致。

3.1.2 热电阻

导电体的电阻率与温度的对应关系,可以被用于感知物体的温度。2013年Binslem等[10]通过纳米针实现了针对单细胞的温度热传感微流控系统,其中纳米针材料为钨,经过建模分析电热表征后,表明在297～313 K内可实现实时准确获得0.1 K的温度分辨率。

2015年Kido等[11]利用被测生物体细胞的电极化性质与温度的关系,表征被测生物体的温度。将2个棒状介电泳(DEP)金电极插入到胡萝卜原生质体内,2个电极从外接电路获得微量的电压时,胡萝卜可视为1个电阻,在外电路中形成微电流；改变胡萝卜的温度,电阻即发生改变,当电流恒定时通过观测两电极间的电压可以获取被测体的温度。

2018年Li等[12]提出了利用金属铂表面培养细胞,测量细胞产热能力的方法。将人微血管内皮细胞群培育在薄膜铂表面上,其中在薄膜铂表面与细胞之间的培养基液注入去甲肾上腺素使细胞温度升高,测量铂的电阻变化值,感知细胞的微小温度变化。

2019年Kim等[13]设计了一种可实现420 pW代谢功率的薄膜聚对二甲苯(parylene)微流控芯片量热计,在微流控腔室内感知细胞代谢热,利用氧化钒(VOx)热电阻温度计实现高灵敏度测温。当偏置电压大于0.5 V时,热电阻的温度分辨率约为15 μK；再利用电热脉冲对微流体系统中测量方的加热器进行变功率加热,根据线性拟合温度变化和输出电压获得热导率,得以精确测量细胞的代谢热。

热电偶和热电阻测量温度响应较快,分辨率较高,但通常会对细胞造成不可逆的伤害甚至致死,在与细胞接触测温时存在温度交互易引入偏差,因此温度复现测量准确度不高,无法生成三维热图像。微纳热电偶结构尺寸在一定程度上会影响温度测量的精度,尺寸过小时,感知能力会减弱,测量偏差变大。此外,微纳热电阻不易植入细胞测量内部温度情况,仅能获得细胞外表层微小的温度变化。

3.2 红外热像测温

物体表面具有向外环境热辐射的能力,根据普朗克辐射定律,物体表面的辐射度取决于其表面的温度。常温附近,物体表面的热辐射集中于中红外光谱,采用红外热像仪收集物体表面的辐射能,即可探测物体表面的温度。由于恶性肿瘤的温度高于正常细胞,通过扫描人体表面可实时获取温度分布,因此被广泛应用于排查肿瘤、诊断乳腺癌等。早在1997年Gamagami等[14]对比了X光机和红外热像仪对乳腺癌的预测性,指出红外热像仪的预测能力更高,而且是唯一能显示化疗对炎症性乳腺癌疗效的技术手段。1998年Paulik等[15]利用红外热像仪对微量滴板上培养的人类脂肪细胞的产热过程实时测量,温度分辨率达到2 mK。2011年Flores-Sahagun等[16]采用红外成像分析技术对皮肤基底细胞癌患者进行早期筛查,根据测量得到的温度梯度对照组进行病情分析,高效识别受损组织。Qi等[17]在2012年分析了红外热像测温对乳腺癌的筛选性,并提出利用热像采集、特征分割提取及有效识别研究图像中不对称的可疑区域,能够发现早期癌症疾病。

红外热像仪可直接实时获得热分布图像,响应时间快,且不破坏细胞结构；但仅能用于测量生物体表面的温度,容易受到外界环境的影响造成测量误差,例如介质的浮动、周围物体的辐射干扰等。

3.3 磁性纳米粒子测温

具有超顺磁特性的磁纳米粒子在低磁场激励下,不存在磁滞现象,磁化率较高,根据居里顺磁原理可知：磁化响应强度较弱,具有更强的温度敏感性,且其粒子直径在10 nm左右,可被细胞吞噬,故而能够通过测量磁性纳米粒子磁化率,实现细胞内部的温度测量[18]。

2009年Weaver等[19]利用磁性纳米颗粒进行测温并获得温度分布,实验利用磁性纳米颗粒在正弦磁场中的第五次和第三次谐波的单调比值生成校准曲线,用于估算温度变化,在293～323 K温度范围内,标准差为0.3 K。

2012年Zhong等[20]利用磁化率与温度的关系,构建了磁化率与温度之间的数学模型,在310～350 K温度范围,测温重复性优于0.55 K；随后,在交变低频外加磁场作用下,记录磁化曲线,实时地探测温度,测温的重复性提高到0.2 K[21]；2018年,Zhong等又提出通过扫描磁性粒子光谱仪测量谐波空间分布的方法获得温度图像,实现空间分辨率约为3.5 mm[22]。

2015年Zhou等[23]提出利用交流磁场中测量得到的基波和三次谐波,采用傅里叶级数求解方程获得温度值,重复性达到0.29 K。

磁性纳米粒子借助对温度敏感的磁化强度与磁化率进行温度测量,其测温精度由外加磁场的状态、磁化曲线的测量和构建模型的反演求解准确性所决定。理论上,测量磁性纳米离子的磁化曲线,便可以通过适用于超顺磁性的朗之万函数构建相关模型进行反演计算获取温度信息,但在高频强磁场作用下,磁纳米粒子会产生动态弛豫特性影响磁化响应,不再表现出超顺磁性,朗之万函数将不再适用,只能通过磁化率与具有温敏性的有效弛豫时间之间的关系构建新模型实现温度测量。

3.4 荧光测温

荧光法是生物研究领域广泛使用的温度标志、测温方法,通常是由于其内部电子能级跃迁,在入射光的激发后产生荧光,通过观测其荧光强度、峰值位置、衰减寿命及强度比等与温度的变化关系,获得所测物质的精确温度及分布情况。按照观察量的不同,可将基于物质产生荧光的测温方式分为6类： 荧光强度、峰值位置、光谱线宽、荧光强度比、偏振各向异性与荧光衰减寿命。各类方式的测温原理以及应用见表2。

用作指示温度的荧光标志可分为生物体外的荧光标志(本文称作体外荧光标志)和生物体自身的荧光标志(体内荧光标志)。体外荧光标志,如荧光染料、量子点、荧光纳米颗粒等,它们不是生物体的构成元素,尺寸小,体外荧光标志的空间尺度可达到5 nm,可被细胞吸收,具有较高的荧光强度、温度探测的灵敏度和宽广的敏感范围。

3.4.1 荧光染料

在生物实验中荧光分子微团被广泛用于温度示踪粒子,其发光强度、衰荡寿命与温度相关。2001年Ross等[24]在微流体系统中使用多种荧光染料进行温度测温,测温精度在0.03～3.5 K之间。荧光染料中被广泛使用的罗丹明B,容易被吸附在塑料表面,即使用缓冲液冲洗后也仍然会残留壁上,会导致温度测量的系统误差。

2007年Suzuki等[25]利用填充热敏荧光染料(Eu-TTA)的微玻璃管检测了单个HeLa细胞的产热,单个HeLa细胞在离子霉素的刺激下导致细胞内外钙离子浓度变化,从而引起细胞温度的改变,通过荧光强度可指示温度的改变。同年,Jigami等[26]在298～308 K温度范围内观测验证了Cy3染料的温度依赖性,并制作了一种利用近场光纤和Cy3荧光染料团的温度响应系统,在100 nm的空间分辨率下获得局部温度梯度为4 K。

2015年Arai等[27]提出一种针对线粒体温度测量的荧光染料(Mito thermo yellow),发现被染料染色后的线粒体对温度变化更加敏感,并成功获得细胞内温度梯度图像。同年,鲁维等[28]使用罗丹明B染料将细胞进行4 h染色,利用共聚焦显微镜和光纤测温仪进行实时温度测量,拟合得到染料荧光强度与温度的关系式；同时还发现在温度上升时,染料测温较准确,在温度下降时,出现较大的偏差。同年,Homma等[29]设计了由2种罗丹明染料(Rhodamine B和CS NIR dye)组成的线粒体靶向温度标志；由于罗丹明B染料的荧光强度随温度升高而线性下降,而CS NIR dye的荧光强度不随温度改变,是恒定值,故通过检测这2种染料荧光强度的比值变化,检测线粒体的温度情况。

表2 荧光测温原理及应用汇总表Tab.2 The fundamentals of fluorescent thermometry and their applications

3.4.2 荧光热敏性聚合物

荧光热敏性聚合物受热后,其结构发生改变,荧光强度也随之变化,且其结构在一定温度范围内可逆,但测温空间分辨率不够高。

2003年Baker等[30]利用具有高粘度系数和热流体特性的离子液体(ILs)溶解热敏性聚合物1,3-bis(1-pyrenyl),在298.1～413 K范围,通过比率发光(不同温度下单体和准分子测量得到的荧光强度比)实现温度测量。2009年Uchiyama课题组[31]将一种热敏聚合物与一种水敏荧光团结合制成了一种荧光纳米凝胶温度计(FNT),在活细胞中,FNT在300～306 K范围内温度分辨率约0.29～0.5 K对温度的变化表现出较高的敏感性；然而,FNT只能测量整个细胞的平均温度。该课题组[32]于2012年发表了改进的荧光聚合物温度计(FPT)研究,利用荧光寿命探测温度,避免了荧光强度受光源稳定性和周围环境光的影响对测量造成的干扰,测温的分辨率达到0.18 K。

3.4.3 荧光生物分子

活细胞可通过某些特定可诱导热休克或冷休克的核酸分子和蛋白质等生物分子来感知温度。对于冷休克,细胞生长趋于停止,伴随着大量基因表达的显著降低,并且冷休克蛋白被表达；热休克也是相同道理。

(1) 基于核酸分子

RNA温度计[33]是一类通过控制基因表达实现温度传感的非编码RNA,选择性地感知温度,依赖于高度结构化的5’端非翻译区,温度改变会使得Shine-Dalgarno(SD)序列二级结构形成屏蔽或暴露,从而促进核糖体结合和翻译起始,最后通过构象变化将信号传递给翻译机器。2006年Chowdhury等[34]通过调控核酸分子RNA,获得细菌RNA温度计的第一个3D-NMR结构；针对WT MiniROSE和ΔG83 MiniROSE两种RNA温度计进行温度响应测试,发现WT MiniROSE在启用SD序列周边时有些不稳定,会造成部分核糖体与亚单位结合翻译,产生编码蛋白,影响基因表达与温度测量。2018年Loh等[35]利用2个或多个RNA温度计对细菌进行温度测量,从而更多地控制和预测多种病原体的基因表达；实验通过对假结核杆菌和钩端螺旋体等随温度变化的构象变化分析,深入了解其动态RNA结构。RNA温度计通过降低生长温度来调节基因表达,产生可分析的分子或代谢表型,并利用这种方式获取细胞内具有研究价值的信息。

2012年Ke等[36]提出了一种基于L-DNA分子信标的可逆细胞纳米温度计,L-DNA是由天然D-DNA的光学异构体构建的双标记发夹寡核苷酸,即镜像异构体。实验中将2种分子信标导入HeLa细胞,在293～310 K的温度范围内,监测荧光强度与温度的关系曲线,得到L-DNA荧光强度随温度的增加而增加，见图2所示。。

图2 L-DNA分子信标纳米温度计[36]Fig.2 L-DNA molecular beacon nano-thermometer

(2) 基于蛋白质

1962年,Shimomura等[37]在维多利亚多管发光水母中首次发现能够在蓝光照射下发出绿色荧光的蛋白质,简称为绿色荧光蛋白(GFP)；其具有良好的生物相容性,对环境不敏感,但荧光强度低。Osamu Shimomura、Martin Chalfie和Roger Y Tsien因为发现和研究改造GFP,获得了2008年诺贝尔化学奖[38]。2006年Leiderman等[39]研究了在87～291 K温度范围内绿色荧光蛋白作为生物荧光标记物的温度依赖性,实验中利用时间相关单光子计数(TCSPC)技术在受光激发后获得光致荧光的衰减时间曲线,并发现低温下酸性GFP校正后的荧光衰减渐近于t-1/2(t为时间)。而在2012年,Donner等[40]将GFP作为温度标志,在转染GFP的癌细胞上进行了测试,利用细胞周围的金纳米棒加热细胞,检测荧光偏振各向异性(FPA),实现了温度的实时表征。

2019年Savchuk等[41]展示了如何使用绿色荧光蛋白来评估温度,使用标准的GFP转染试剂来评估细胞内线粒体中表达GFP的HeLa细胞的温度,并提出了一种新的荧光峰值分数(PF)进行温度测定的方法,该方法利用比值测量技术,不依赖于样品浓度和激发功率的变化,PF随温度呈线性增加,在温度周期内具有较好的重复性。

3.4.4 荧光纳米颗粒

(1) 量子点

半导体纳米粒子,又称量子点,一般尺寸为1～100 nm,光学性质稳定,可在第一激发态上的任意波段受激发,通常温度与荧光强度成线性反比关系,可通过改变颗粒大小调节荧光发射峰波长。

2006年Aigouy等[42]在AFM针尖上放置包裹着CdSe/ZnS量子点的二氧化硅球作为荧光探测器,通过针尖的移动对物体进行扫描获取热成像,但仅限于表面测温；通过不同的样品和激发波长实验,证明了量子点宽光谱的传输特性。2010年Maestro等[43]发现硒化镉(CdSe)量子点在双光子激发下荧光发射强度的温度热成像对比度和灵敏度更高,并将其应用在单个HeLa细胞中进行温度测量,在温度升高后,峰值位置发生改变。2011年Yang等[44]利用量子点(QD655)的光致发光光谱描述了NIH/3T3小鼠纤维细胞内的热变化现象,实现了对细胞内部不均匀温度的实时观测,发现单个活细胞在化学和物理刺激下的局部温度响应；实验利用Ca2+离子化学诱导细胞使温度升高,并观察到光谱红移现象。

(2) 金属纳米粒子

金属纳米粒子拥有更小的尺寸、良好的生物相容性以及较高的温度敏感性,当被激光激发时,在一定温度范围内其荧光寿命会随温度的变化而变化,从而测得温度。

2009年Huang等[45]详细介绍了金纳米颗粒的各种合成方法：种子介导生长法、电化学法、光化学还原法等；并概述了金纳米颗粒在生物学和生物医学领域的应用研究。2010年Zhang等[46]将对激发极化敏感的双光子荧光金纳米颗粒导入犬肾脏细胞中进行荧光寿命光学成像,发现其发光寿命小于100 ps,温度探测灵敏度优于很多荧光分子。

2013年Li等[47]报道了荧光金纳米团簇(AuNCs)荧光寿命在一定温度范围内随温度的升高而明显降低;实验使用HeLa细胞吞噬AuNCs,施加温度梯度,再通过荧光寿命成像观测细胞内部温度分布状况，发现温度引起的寿命缩短与环境有关，且寿命长短会影响图像数据采集的速度，从而引入测量误差。

(3) 稀土掺杂纳米粒子

稀土离子的能级结构丰富,在受到相应的泵浦光激发后会产生较宽的荧光光谱,与温度等因素存在一定的关系。

1976年Kusama等[48]提出采用硫氧化钇铕(Y2O2S: Eu)的2种不同跃迁能级方法产生的荧光强度比值进行温度的测量,并建立了一定范围内荧光温度测量标准。2010年Vetrone等[49]通过对比多光子激发荧光NaYF4：Er3+：Yb3+纳米晶、量子点以及金纳米颗粒作为生物荧光标志时的荧光强度,证明了掺杂纳米粒子的荧光转换效率远高于其它两个。同年,首次实现利用稀土掺杂的纳米荧光材料的荧光强度比在单细胞内进行测温,在298～318 K温度范围下,利用共聚焦显微镜观测吸收NaYF4：Er3+：Yb3+纳米粒子的HeLa细胞内部荧光强度变化,获得实时温度[50]。

2011年Dong等[51]利用2种不同稀土原子掺杂CaF2的纳米晶对HeLa细胞进行温度测量,选取2个激发波长的荧光强度值进行比值计算,发现荧光强度比与温度存在线性关系。

(4) 纳米金刚石

金刚石氮-空位(nitrogen-vacancy,NV)色心是由1个取代了碳原子的氮原子,及其邻近处缺失的1个碳原子空位组成的复合结构。在没有外磁场的情况下NV色心自旋三重态的基态呈自旋能级ms=±1的简并态,基态能级ms=0与ms=±1之间的频率差称为零场劈裂。利用微波对NV色心的自旋态进行操控,配合激光进行基态自旋初始化和读出,并连续监控NV中心的荧光强度并扫描微波频率得到光磁共振谱线及零场劈裂能D,进而根据D值与温度的关系,进行高精度的温度测量。1997年德国Wrachtup研究组[52]首次利用共聚焦系统研究了单个NV色心并实现了其在室温下的光探测磁共振信号,从此金刚石NV色心就引起了全世界物理学家的广泛关注。2008年德国Wrachtup研究组和美国Lukin研究组同时实现了金刚石NV色心的直流和交流磁场纳米尺度的探测技术,从此引发了人们利用NV色心去探测其它物理量的热潮[53,54]。目前已实现较宽的温度范围5～600 K内的测量[56～58]。

图3 细胞纳米测温[58]Fig.3 Nanoscale thermometry in cells

2015年, Laraoui等[61]利用金刚石纳米NV色心附着在原子力显微镜(AFM)的硅热尖端作为局部温度传感器,获得不同表面热导率的热变化图,且温度时间响应速度较快。

2017年, Neeraj等[62]经实验观察发现细胞可以通过连续的内吞作用和胞吐作用来调节FND,证明了FND与细胞吸收的相互作用。2018年, Sekiguchi等[63]证明了FND的热敏能力不受外部环境影响,并提出一种应用于细胞内部的绝对温度测量方法,在单个细胞中其测温精度优于±1 K。

荧光纳米金刚石NV色心性质稳定,具有超高热惰性和耐酸碱性,无色无毒[64],由于其优异导热性使得NV色心与周边环境处于热平衡状态,不存在温度扰动影响测量精度的情况,加之可以通过不同的微波脉冲操控方式消除外部磁场波动、共振谱线加宽等不确定因素,实现超精细能级调控；且NV色心体积较小,具有生物相容性,可被细胞胞吞胞吐,有望于应用在医疗药物投掷至靶癌细胞上,以及通过实时获取温度可控制加热用以抑制癌细胞等生物医学方面。

3.5 混合结构测温

2012年, Albers等[65]制备了一种中心为CdSe/CdS量子点-量子棒,外层由花菁染料(Alexa-647)聚合物包裹的混合结构的温度标志,该方法采用双激光激发法产生2个不同波段的荧光强度,利用其比值与温度的线性关系,实现了0.2 K的测量精度,并开展了HeLa细胞在水溶液和碳酸氢盐缓冲液中测温比率响应对比实验。

2014年, Qiao等[66]设计了一种由热敏聚合物(PNIPAm)分别与荧光染料(NBDAA)和罗丹明B衍生物(RhBAM)组成的基于比例荧光聚合物(RFPs)的纳米温度计,可精确测量活细胞的温度。RFP标志可自校准荧光发射强度,可探测的温差小于1 K。将RFP标志融入Hela细胞,观测到PNIPAm-co-NBDAA通道发射荧光的强度随温度升高而升高,而PNIPAm-co-RhBAM通道变化不大,因此,通过比值通道荧光图像颜色的变化可实现温度测量。

2015年, Wang等[67]提出一种测温范围为283～318 K,用于细胞内部温度测量的磁性荧光纳米颗粒温度计。实验利用Hela细胞吞噬Fe3O4@SiO2@(pNIPAM-co-RhBITC)/Au混合纳米颗粒,发现在299～314 K的范围内,荧光强度与细胞温度呈线性关系,测温灵敏度为-4.84%K-1,且在外磁场的作用下,可实现有磁场导向定位和温度传感。

4 分析与展望

由于细胞内部的复杂结构,在多样的生命活动过程中,细胞的温度变化是无法预料的,周围环境对细胞的影响也是不可估计的。因此在对活细胞进行温度测量时,需要满足高分辨率、低扰动、抗干扰、快速响应和非破坏性等要求。

基于传统热电偶和热电阻测量细胞内温度,测温空间分辨率可达50 nm,不易受中间介质影响,但对设计制作工艺要求较高,其结构尺寸一定程度上影响温度测量精度,加之热电偶和热电阻测量时传输电信号,一般需要引线或者在某微纳加工表面上进行测量,引线及基底限制了使用环境。红外热像仪在规定范围内可快速定位热点或冷点,测量的空间分辨率约在0.1～1 mrad,但仅能获得表面温度,并且测温精度会受热像仪镜头焦距和周围物体影响,因此在μm量级的单细胞或集群测量时会存在无法精准定位测温的情况。

对于生物体或者细胞内低扰动的温度测量,主要可使用磁性纳米粒子和荧光类测量。磁性纳米粒子可实现在细胞内部测量,有多种获取温度的模型算法,重复性约为0.2～0.6 K,但无法实时获取温度值,且空间分辨率和稳定性较差。荧光染料可直接通过荧光强度获取温度变化,在激光共聚焦显微镜下还可分析细胞温度的三维分布图,但也容易发生光漂白现象,稳定性较差。荧光热敏性聚合物可绘制细胞内部细胞器的温度图像,但测温空间分辨率不高,响应时间受自身结构影响,且大多需要复杂的合成程序。荧光生物分子可实时读出细胞温度,重复性较好,但荧光强度较低,准确性较差。量子点光化学稳定性高,单一激发光源下可标记并观测多个位置温度,灵敏度较高,但对细胞具有潜在毒性,重复性相对较差。稀土掺杂纳米粒子测温方法较多,但灵敏度和精确度会受能级间隔影响。金属纳米粒子发光稳定,测量精度较高,但易被激光长时间照射而导致加热,现多用于细胞内部加热控温。

相比较而言,由于金刚石NV色心可制作成为10 nm至微米不同尺寸的颗粒,适应多种类细胞测量,具有响应速度快,化学稳定性较高,对生物体友好等优点,目前已有研究表明该方法具有高温度分辨率和高测量灵敏度的潜力,在可编码的测量序列下具有较强的抗干扰性,且在室温下可实现量子调控,是一种优异的量子传感器。此外,金刚石NV色心不仅可作为温度传感,也可作为磁场、电场传感介质,有望进行多物理场测量。因此,基于金刚石NV色心及其混合结构的测温技术可以有效弥补传统细胞测温技术的不足,为生物体及细胞的温度测量提供一种新的技术方案。

目前,我国在金刚石NV色心测温领域的研究才刚起步,对于测量方法、定量化技术参数、计量学特性等方面的研究尚不深入,并且缺乏在生物体及细胞测温应用方面的研究,未来该领域需要得到广泛和持续性的关注和发展。

5 结 论

本文综述了5类应用于微纳米尺度生物体温度测量方法的代表性研究进展,对比分析了各种技术的优缺点。在已有的研究方法中,基于金刚石NV色心的测温技术可在常温下实现量子传感,具有较高的空间、时间和温度分辨率,以及良好的稳定性与生物兼容性。鉴于生物医学、新材料以及智能制造等领域对微纳米尺度高精度温度测量技术的需求,在未来需持续深入开展研究，解决限制技术发展的关键问题,不断提高微纳米尺度温度测量性能。