巨噬细胞在肝癌发生、发展中的作用机制及其靶向治疗研究进展

黄鑫昱 苏盛元 王开琛 王甘露

肝癌(Hepatocellular carcinoma， HCC)占全球原发性癌症的80%以上[1]，5年总体生存率仅为10%。诸多研究表明，炎症，特别是慢性炎症，如慢性乙型肝炎，是影响肝癌发生、发展最重要的因素[2]，而巨噬细胞大量积聚是慢性炎症的重要特征。巨噬细胞在肿瘤发生、发展过程中发挥了“双刃剑”。一方面，巨噬细胞通过固有免疫杀死并清除病变细胞；另一方面，巨噬细胞的极强可塑性(plasticity)，使其在肿瘤微环境下，可迅速转化为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，从而促进肿瘤细胞的生长、侵袭，新生血管生成以及具有免疫调节功能。此外，巨噬细胞与肝癌耐药性密切相关[3]。因此，通过靶向清除或转化巨噬细胞及中和其代谢产物成为肝癌研究热点。

一、肝巨噬细胞的来源和异质性

动物和临床研究表明，肝脏巨噬细胞呈现显著的异质性。根据来源不同，分为组织固有(tissue-resident)的巨噬细胞和单核来源(monocyte-derived)的巨噬细胞。肝脏组织固有的巨噬细胞，即库普弗细胞，主要由卵黄囊的红系髓样祖细胞发育而来，它们在胚胎时就进入肝脏，能自我更新，对肝脏稳态和免疫耐受具有重要作用[4]。在正常生理条件下，单核细胞来源的巨噬细胞数量较少，约占5%～30%[5]，当肝组织损伤时，会招募大量单核细胞进入组织。根据表型和功能差异，巨噬细胞可分为经典活化型巨噬细胞(M1)和替代活化型巨噬细胞(M2)。M1型巨噬细胞释放的趋化因子、细胞因子以及蛋白水解酶，能诱发各类白细胞浸润和活化，并具有强大的抗原递呈能力，因此，参与对病原体及病变细胞的免疫应答，发挥免疫监视功能；M2型巨噬细胞，主要由IL-4和IL-13诱导活化，其抗原递呈能力较弱，分泌抑制性细胞因子，如IL-10、TGF-β，在免疫调控和组织修复过程中发挥重要作用[6]。

二、巨噬细胞在肝癌发生、发展中的作用机制

诸多研究证明，肿瘤组织中浸润的巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)在肿瘤免疫逃逸、肿瘤细胞恶性转化、肿瘤血管生成等过程中发挥了重要作用[7]。一方面，在肿瘤发生初期，巨噬细胞作为固有免疫系统的重要成员，可直接识别和清除肿瘤细胞，并招募和活化T细胞对肿瘤细胞的免疫响应；另一方面，巨噬细胞作为肿瘤组织中最为丰富的免疫细胞，在局部组织产生大量活性氧和活性氮，导致DNA损伤及基因组不稳定[6]；同时，损伤的组织细胞刺激巨噬细胞不断产生各类生长因子，使细胞增殖异常活跃。因此，不同阶段TAM对肿瘤发生、发展的影响截然不同，与之相应的，TAM功能表型也由早期的M1型逐步极化为M2型。此外，肿瘤细胞分泌多种趋化因子，如CCL2和M-CSF[8-9]，招募单核细胞进入组织并分化为巨噬细胞，进一步强化巨噬细胞对肿瘤发展的作用。

多个临床研究也证实，肝癌组织中巨噬细胞的密度与肿瘤大小、肝内转移情况、TNM分级以及不良预后(如生存期、耐药性)密切相关[10]。我们将重点阐述TAM影响肝癌发生、发展作用机制，以及靶向清除或转化巨噬细胞及中和其代谢产物相关治疗方案的研究进展。

(一)构建免疫耐受的肿瘤微环境

与M2型巨噬细胞类似，TAM抗原递呈能力差，而且其释放的精氨酸酶1、IL-10和TGF-β 能抑制T细胞的抗肿瘤活性。Kuang等[11]发现，在肝癌组织中，单核细胞来源的TAM通过TNF-α和IL-10以自分泌的方式上调PD-L1的表达，从而抑制T细胞的增殖和对肿瘤细胞的杀伤。利用PD-L1抗体阻断PD-L1后，可解除TAM对T细胞肿瘤的免疫抑制，并抑制肝癌细胞的生长[12]。近年来Wu等[13]也报道了类似结果。他们发现，TREM-1+TAMs富集在肝癌的缺氧区域，并且与不良预后相关。TREM-1+TAMs通过上调PD-L1表达，抑制CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤。TIM-3是一种T细胞表面抑制分子，结合配体后，能够引起T细胞的衰竭。Li等[14]发现，在HBV相关HCC患者肝癌组织内的TAM高表达TIM-3的配体分子galectin-9。免疫荧光实验显示，在肝癌组织中，TIM-3+T细胞与galectin-9+TAM相邻分布。阻断galectin-9与TIM-3相互作用，能逆转肿瘤侵润的T细胞耗竭并恢复它们增殖和分泌细胞因子的功能。

此外，多个临床研究发现，HCC患者肝癌组织中的Tregs数量显著多于癌旁和正常组织[15]，多变量分析表明，Tregs密度是HCC不良预后的独立预测因素[16]。Zhou等[17]发现，肝癌肿瘤组织内Tregs数量与TAM密切相关。动物实验表明，清除肝脏组织内的巨噬细胞能显著降低肿瘤内Tregs数量；进一步的体外实验显示，肝癌细胞培养上清液处理巨噬细胞刺激CD4+T细胞分化为Tregs。Wu等[13]发现，TREM-1+TAMs能通过上调CCL20表达水平，招募CCR6+Tregs在肝癌组织的聚集。

综上，TAM通过直接分泌或细胞表面的免疫抑制因子以及招募免疫抑制性细胞Tregs，为肝癌发生、发展提供免疫耐受的微环境。

(二)促进肝癌的血管生成

巨噬细胞是调节肿瘤血管生成的关键参与者，能分泌大量促血管生成因子和调节血管生成的酶类刺激肿瘤血管的新生[18]。Bartneck等[19]发现，CCR2+ TAM聚集在肝癌肿瘤新生血管的周围。动物实验表明，抑制巨噬细胞在肝癌组织的募集能够显著降低瘤内的血管密度并抑制肿瘤生长。Zang等[20]发现，HBV相关HCC患者外周血中IL-23的浓度显著高于正常人。进一步研究表明，HBV抗原能够刺激肝脏内巨噬细胞分泌IL-23，同时，IL-23以自分泌方式通过JAK-STAT3信号通路上调VEGF-A等多个促血管生成因子的表达，促进肿瘤血管的生成，而阻断IL-23作用，能抑制HBV转基因小鼠肝癌的发展。

(三)促进肝癌细胞恶性转化

肝脏损伤能刺激巨噬细胞NADPH氧化酶(NOX)的表达和活化，产生大量活性氧，诱导基因突变，同时，巨噬细胞会分泌多种因子促进存活的肝细胞进行代偿性增殖，使得突变不断累积。Liang等[21]利用DEN诱导小鼠原发性肝癌研究发现，条件性敲除巨噬细胞NOX4基因后，Nox1ΔMac小鼠肝癌肿瘤数量和大小显著低于野生型。机制研究表明，NOX4是巨噬细胞调控肝细胞坏死诱导的炎症响应和肝细胞补偿性增殖的关键基因；临床实验也显示，HCC患者肿瘤组织内NOX4在TAM表达水平显著高于癌旁组织。

研究发现，肝癌组织内的TAMs分泌的IL-6、IL-8[22]、TGF-β、EGF、 MMP-2和 MMP-9等能促进肝癌细胞的上皮-间质转化(EMT)，并提高其侵袭转移能力[23]。HCC患者外周血IL-6浓度显著高于正常人，而且与HCC性别差异、慢性肝炎的癌变以及HCC的不良预后密切相关[24]。Jiang等[25]发现，TMAs分泌的IL-6在缺氧条件下能够促进肝癌细胞的上皮-间质转化(EMT)以及肝癌细胞在裸鼠体内的转移。

综上，TAMs能通过氧化应激诱导基因突变、分泌细胞因子或酶等促进肝癌细胞EMT和侵袭转移，从而提高肝癌细胞的恶性程度。

(四) 提高肝癌细胞对化疗药物耐受性

巨噬细胞在靶向药物耐药中的重要性也受到越来越多的重视。Zhang等[26]发现，清除肝癌组织中巨噬细胞后能显著增强索拉非尼的治疗效果，使得原位肿瘤缩小及肺内转移减少。近来，Dong等[27]发现， M2型巨噬细胞通过大量分泌HGF拮抗索拉非尼对ERK1/2/MAPK信号通路的抑制效果，从而促进肝癌细胞生长。Fu等[28]发现，HCC患者肿瘤组织内TAMs密度与奥沙利铂治疗耐药程度呈正相关。细胞实验表明，TAMs能激活肝癌肿瘤细胞的自噬作用，提高对奥沙利铂耐受性。

综上，肝癌肿瘤组织内的巨噬细胞分泌的产物通过活化靶向药物作用的信号通路或激活肿瘤细胞自噬作用，从而抑制靶向药物对肿瘤细胞的杀伤或抑制。

三、靶向TAM的肝癌治疗方案

目前，靶向TAMs的治疗方案包括抑制单核细胞来源的巨噬细胞招募、清除肿瘤组织已有TAMs、诱导TAMs功能表型转化和中和TAMs分泌的促肿瘤因子(表1)。

表1 靶向TAM的肝癌治疗方案

(一)抑制单核细胞来源的巨噬细胞招募

CCL2/CCR2是调控实体肿瘤单核细胞来源巨噬细胞招募的关键通路[29]。研究发现，CCL2在HCC肿瘤组织中呈现高表达并与HCC不良预后有关，阻断CCL2/CCR2信号通路可以阻断肝癌单核细胞的募集和TAM的M2极化。Wang课题组将CCR2拮抗剂注射到原位肝癌模型小鼠腹腔后发现，肝癌瘤内TAMs数量显著减少，而CD8+T细胞大幅增多，显著抑制了肿瘤的生长[30-31]。Teng等[32]发现,CCL2单抗能抑制CD11bhighGr1+单核细胞在肝脏内的积累以及肿瘤细胞在肝癌模型小鼠体内的生长。

(二)清除肝癌组织中的TAMs

肝癌组织中巨噬细胞的密度与肿瘤大小、肝内转移情况、TNM分级以及不良预后(如生存期、耐药性)密切相关。Zhang 等[26]发现，通过唑来膦酸或脂质体(负载氯磷酸盐)清除小鼠肝癌组织内的巨噬细胞，能显著增强索拉非尼的治疗效果，使得原位肿瘤缩小及肺内转移减少。Zhou等[33]发现，与肝动脉化疗栓塞术相比，联合靶向清除巨噬细胞的治疗方案能持续抑制肝癌肿瘤的生长和肿瘤血管的新生。

(三)诱导TAM功能表型的转化

随着肿瘤发生、发展，TAM从早期抗癌的M1型巨噬细胞不断转化为促癌的M2型巨噬细胞。Sprinzl等[34]发现，化疗药物索拉非尼能改变巨噬细胞的功能表型，抑制生长因子IGF-1的分泌，控制M2型巨噬细胞诱导的肝癌细胞生长。Tan等[35]发现，天然黄酮化合物黄芩苷能特异性地诱导小鼠肝癌组织内MR+M2型巨噬细胞极化为iNOS+M1型，从而抑制小鼠肝癌的生长。

四、小结

TAMs是HCC肿瘤组织数量最多的免疫细胞，通过释放大量活性氧、活性氮、细胞因子、生长因子和基质蛋白酶等，为肿瘤细胞的恶性转化、免疫逃逸以及侵袭转移提供了有利条件，因此，其数量和功能表型常与HCC临床表现密切相关，TAMs也成为HCC免疫治疗的重要靶标。目前，靶向巨噬细胞治疗肝癌的研究方向主要包括抑制单核细胞的募集、清除已有的TAMs、诱导TAMs再分化等。期望通过这些方法控制TAMs在肝癌组织的数量或恢复其肿瘤免疫监视的功能作用，从而抑制肝癌的生长、侵袭转移以及血管新生。