LncRNA ZFAS1作为ceRNA吸附miR-541-3p调控胃癌侵袭转移①

王 慧 姚振涛 白淇文 王赛琪④ 孙克然④ 陈小兵④⑤

（郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院内镜中心，郑州 450003）

胃癌是一种源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在中国发病率和病死率都处于较高水平，地域环境、饮食生活习惯、幽门螺杆菌感染、遗传等多种因素可导致发病［1-2］。目前的治疗方法主要有手术治疗、化疗、靶向治疗等，预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型等多种因素有关，早期胃癌预后较好，但早期胃癌患者大多无明显症状，很难被诊断出来［3-5］。因此，探究胃癌进展的分子机制变化是十分重要的。

近些年，随着对非编码RNA 的研究逐渐深入，关于LncRNAs 和miRNAs 在胃癌中的作用也受到广泛关注［6-7］。LncRNA 是一类长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，能参与调控表观遗传、细胞分化等多种生命活动，有大量研究报道其能作为ceRNA 在包括胃癌在内的多种疾病中发挥作用［8-9］。锌指蛋白反义链1（zinc finger-protein antisense chain 1，ZFAS1）在大肠癌、食管鳞癌等多种消化系统疾病中作为致癌因子发挥作用［10-11］。ZHANG 等［12］发现，ZFAS1 在胃癌组织中表达上调，并且可以通过miR-200b-3p/WNT1 轴调控胃癌的恶性进展；XU 等［13］报道下调LncRNA ZFAS1能够通过阻断胃癌细胞中的Wnt/β-catenin信号来抑制恶性肿瘤。本研究将通过后续实验进一步证实ZFAS1在胃癌中的作用。

ceRNA 假说阐述了一种RNA 之间相互作用的形式，miRNAs通过mRNA影响基因的表达，而ceRNA可通过竞争性吸附miRNA 对基因表达产生影响，从而对疾病的进展进行调控［14］。miRNA 是长度为20～24 个核苷酸的非编码RNA，能在转录后水平上调控基因的表达，从而影响生物学进程［15］。miRNA能够参与胃癌的进展，且不同的miRNA 发挥的作用不同。例如，miR-876-5p 在胃癌中发挥抑瘤作用，并且能够促进胃癌细胞对顺铂的敏感性［16］；而miR-96-5p 则会促进胃癌细胞的增殖［17］。miR-541-3p 被报道能够在前列腺癌、小细胞肺癌中发挥抑癌作用，在胃癌中的作用尚未明确［18-19］。

因此，本文选取LncRNA ZFAS1 和miR-541-3p，通过一系列实验证明二者的靶向关系，并探讨其在胃癌中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 人胃黏膜上皮细胞GES-1 以及人胃癌细胞株SGC-7901、MKN45、BGC-823 均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；RPMI1640 培养基（22400097）、Trizol 试剂盒（15596026）、BCA 试剂盒（23227）均购自Thermo Fisher；细胞转染试剂盒Lipofectamine 3000（L3000-015）购自Invitrogen；细胞转染序列由上海吉玛基因公司提供；荧光原位杂交试剂盒购自锐博生物；双荧光素酶试剂盒（E2920）购自Promega；TransScript ⅡGreen One-Step qRTPCR SuperMix 试剂盒（AQ311-01）购自全式金；一抗MMP2（ab97779）、MMP9（ab38898）和二抗山羊抗兔IgG（ab150077）均购自Abcam 公司；RIPA 裂解液（R0010）、基质凝胶（M8370）、Annexin V-FITC/PI 试剂盒（CA1020-20T）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 仪器 酶标仪（MultiskanTMFC）购自Thermo Fisher；荧光定量PCR 仪（7500）购自美国ABI 公司；显微镜（BX53M）购自OLYMPUS；流式细胞仪（Cyto⁃FLEX）购自贝克曼库尔特。

1.2 方法

1.2.1 组织样本收集 选取郑州大学附属肿瘤医院41例胃癌患者的癌组织和癌旁组织，所有患者均行胃癌切除术且术前未接受相关手术或放化疗治疗。切除后立刻将样本组织置于液氮中冷冻并置于-80 ℃保存备用。本研究经郑州大学附属肿瘤医院伦理委员会审批同意且所有患者知情同意，患者临床资料完整且接受随访。

1.2.2 细胞培养和转染 将胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞株SGC-7901、MKN45、BGC-823 培养于含胎牛血清及青霉素、链霉素的RPMI1640 培养基内，将其置于37 ℃、5%CO2的环境中，ZFAS1 表达最高的癌细胞被用于后续试验。将对数生长期的细胞转染shRNA scramble、CCAT1 shRNA 及miR-541-3p inhibitor 等并分组。转染步骤依据Lipofectamine 3000试剂盒说明书进行。

1.2.3 亚细胞定位预测和双荧光素酶实验 使用lncATLAS：（http：//lncatlas.crg.eu/）网站对ZFAS1 进行亚细胞定位预测。荧光原位杂交试剂盒对ZFAS1的亚细胞定位进行验证，检测步骤依据试剂盒说明书进行。RNA22 网站预测ZFAS1 以及miR-541-3p的互作用位点，之后通过双荧光素酶报告实验验证二者之间的靶向关系。将ZFAS1 的野生型（WT）以及突变型（MUT）的3'UTR 片段分别与miR-541-3p mimic 和mimic NC 共转染至293T 细胞，对荧光素酶活性进行检测，转染以及操作步骤均依据Lipo⁃fectamine 3000试剂盒说明书。

1.2.4 Real-time quantitative PCR（qRT-PCR）Trizol 试剂盒用于提取细胞总RNA。利用Trans Script ⅡGreen One-Step qRT-PCR SuperMix 试剂盒一步完成RT-PCR 合成及q-PCR。反应体系和反应条件均依据试剂盒说明书进行。使用实时荧光定量PCR 仪进行扩增，ZFAS1 序列为（正向：5'-ACCG⁃GAAGGCTCACCGATCTAC-3'，反向：5'-TACCGAA⁃CACATGCGGCCAT-3'），miR-541-3p 序列为（正向：5'-CTACATCCCGCATCCGAA-3'，反向：5'-CATGCTTGGACAATACCGC-3'）。ZFAS1 以GAPDH 为内参，miR-541-3p 以U6 为内参，引物序列由华大基因合成。借助2-ΔΔCt法计算相关因子表达量。

1.2.5 Western blot RIPA 裂解液用于提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒对蛋白浓度进行测定。行SDSPAGE 凝胶电泳后将蛋白转移至PVDF 膜。用含5%胎牛血清的TBST封闭后，将PVDF膜与一抗MMP2、MMP9 孵育。之后加入山羊抗兔IgG 作为二抗，PVDF 膜与ECL 液在室温下反应1 min。以GAPDH作为内参，目标条带与内参照条带的灰度值之比作为蛋白质的相对表达水平。采用Image J 对条带灰度值进行定量分析。

1.2.6 MTT 检测细胞增殖活力 将转染后生长良好的胃癌细胞接种于96 孔板上，将细胞置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。分别于24 h、48 h、72 h 换液后在各孔中加入20µl MTT 溶液，继续培养4 h 后弃上清，在酶标仪490 nm波长处测定每孔OD值。

1.2.7 Transwell检测细胞侵袭 细胞转染48 h后，无血清培养基重悬细胞使细胞密度为2×105个/ml。将含有基质凝胶的小室加入24 孔板。于Transwell小室上室加入200µl 细胞悬液，下室加入500µl 含10%胎牛血清的培养基。48 h时将小室取出，5%多聚甲醛固定30 min，之后用0.1%结晶紫染色15 min。在显微镜下对跨膜细胞进行计数。

1.2.8 Annexin V-FITC/PI 双染检测细胞凋亡 取转染后的胃癌细胞，PBS 冲洗，离心后弃上清，调整细胞浓度为5×106个/ml，加入500µl结合缓冲液，之后加入5 µl Annexin-V-FITC 以及5 µl PI 染液并混匀，避光条件下孵育10 min。流式细胞仪检测凋亡情况，激发波长488 nm，于530 nm 下检测FITC，575 nm下检测PI，对细胞凋亡情况进行统计。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0统计软件对数据进行分析。计量资料以±s表示，首先进行正态性和方差齐性检验，检验符合正态分布且方差齐，则组内比较采用配对t检验，组间采用非配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析或重复测量数据的方差分析，组内两两比较采用事后SNK-q检验，若不符合正态性分布或方差齐性则进行秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZFAS1 在胃癌中表达增强而miR-541-3p 表达被抑制 检测癌组织和癌旁组织中ZFAS1 以及miR-541-3p 的表达发现，ZFAS1 在癌组织中表达增强而miR-541-3p 的表达显著降低（均P<0.05）。此外，相对于GES-1，ZFAS1 在癌细胞中表达上升（均P<0.05），同时miR-541-3p 在癌细胞中表达被抑制。其中SGC-7901 变化最明显，因此被用于后续实验。见图1。

图1 ZFAS1和miR-541-3p的表达Fig.1 Expressions of ZFAS1 and miR-541-3p

2.2 ZFAS1 能够作为ceRNA 吸附miR-541-3p 使用lncATLAS网站对ZFAS1进行亚细胞定位，结果发现ZFAS1 在细胞核和胞浆中均有表达，且主要定位于胞浆，推测ZFAS1 能够发挥分子海绵的作用，FISH实验进一步证实了ZFAS1的亚细胞定位（图2）。之后通过RNA22 网站发现其与miR-541-3p 存在互补配对碱基，双荧光素酶报告实验进一步验证了二者之间的靶向关系（图3）。

图2 lncATLAS显示ZFAS1主要定位于细胞质Fig.2 lncATLAS showed that ZFAS1 was mainly locatedin cytoplasm

图3 ZFAS1和miR-541-3p的靶向关系验证Fig.3 Verification of targeting relationship between ZFAS1 and miR-541-3p

2.3 ZFAS1沉默促进胃癌细胞细胞凋亡，抑制其增殖 检测SGC-7901 组、shRNA scramble 组以及ZFAS1 shRNA 组细胞凋亡以及增殖情况，结果发现，相对于SGC-7901 组，抑制ZFAS1 的表达能够显著诱导胃癌细胞凋亡，抑制其增殖活力（均P<0.05）。而SGC-7901 组与shRNA scramble 组的增殖与凋亡差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

图4 ZFAS1对胃癌细胞增殖和凋亡的影响Fig.4 Effect of ZFAS1 on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells

2.4 ZFAS1 沉默能够抑制胃癌细胞侵袭转移 检测各组细胞的侵袭情况以及侵袭转移相关因子的表达情况，结果发现，相对于SGC-7901 组，抑制ZFAS1 表达后细胞侵袭数目显著减少，且MMP2 和MMP9表达被显著抑制（均P<0.05）。shRNA scramble组与SGC-7901 组差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。

图5 ZFAS1对胃癌细胞侵袭转移的影响Fig.5 Effect of ZFAS1 on invasion and metastasis of gastric cancer cells

2.5 miR-541-3p inhibitor 逆转ZFAS1 shRNA 对胃癌细胞增殖凋亡的影响 检测各组细胞增殖和凋亡情况发现，相对于shRNA scramble组，ZFAS1 shRNA组凋亡增多而增殖被抑制，miR-541-3p inhibitor 组凋亡减少而增殖活力增强（均P<0.05）。提示miR-541-3p inhibitor 能够部分逆转ZFAS1 shRNA 对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。见图6。

图6 ZFAS1吸附miR-541-3p调控胃癌细胞增殖和凋亡Fig.6 ZFAS1 regulates proliferation and apoptosis of gastric cancer cells by sponging miR-542-3p

2.6 miR-541-3p inhibitor 逆转ZFAS1 shRNA 对胃癌细胞侵袭转移的影响 检测各组细胞MMP2、MMP9的表达以及细胞侵袭情况发现，相对于shRNA scramble 组，ZFAS1 shRNA 组细胞侵袭数目减少且MMP2 和MMP9 的表达被抑制，而miR-541-3p inhibitor 组中细胞侵袭数目增多，MMP2 和MMP9 表达增强（P<0.05）。miR-541-3p inhibitor能够完全逆转ZFAS1 shRNA对胃癌细胞侵袭转移的影响。见图7。

图7 ZFAS1吸附miR-541-3p调控胃癌细胞侵袭转移Fig.7 ZFAS1 regulates invasion and metastasis of gastric cancer cells by sponging miR-542-3p

3 讨论

随着分子生物学的发展以及对非编码RNA 认识的深入，非编码RNA 在众多疾病中的作用被逐渐揭示，并且为疾病治疗提供了新方法和新思路，其在胃癌中的作用也受到广泛关注［20-21］。在先前的研究中，LncRNA ZFAS1 就被发现在胃癌组织和细胞中表达上调，并且能够通过调节PCNA、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、MMP2 和MMP14 等相关因子的表达，促进癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化，加速胃癌的进展，除此之外，还参与了癌细胞耐药［13］。与既往研究一致，本研究发现LncRNA ZFAS1在胃癌组织和癌细胞中表达上调。为进一步探究其机制，本课题组通过生物学信息工具预测了LncRNA ZFAS1 的潜在靶点，并通过实验证实了LncRNA ZFAS1 与miR-541-3p 之间存在靶向关系。miR-541-3p 被报道通过靶向CCND1 阻碍前列腺癌细胞的增殖和细胞周期进程，miR-541 则通过调控HMGA2 的表达抑制小细胞肺癌的增殖和侵袭［18-19］。本研究对LncRNA ZFAS1 在胃癌中的作用展开研究，发现其在胃癌组织和癌细胞中表达下调。

本研究还发现，沉默ZFAS1 能促进胃癌细胞凋亡，抑制其增殖，而这种作用能够被下调miR-541-3p的表达所逆转，具体的调控机制有待进一步探究。除此之外，沉默ZFAS1 还能抑制MMP2 和MMP9 的表达，从而抑制癌细胞的侵袭转移，同样，这种效果能够通过下调miR-541-3p 被挽救。MMPs 是一类能够降解细胞外基质和基底膜成分的蛋白水解酶，增强癌细胞的运动能力，参与癌细胞的转移和侵袭，通常MMP2 和MMP9 在胃癌中表达上调［22-23］。故推测，ZFAS1 和miR-541-3p 通过调控MMP2 和MMP9对胃癌细胞的侵袭和转移产生影响。

综上所述，ZFAS1可作为ceRNA吸附miR-541-3p，从而抑制胃癌细胞的增殖和侵袭转移，促进细胞凋亡。ZFAS1/miR-541-3p 轴有望成为治疗胃癌的新靶点，但本研究未对其下游基因进行具体探究。miR-541-3p 以往被发现能够靶向CCND1 基因进而调控前列腺癌的进展［18］。而CCDN1 也曾被证实在胃癌中发挥促癌作用［24］。因此ZFAS1/miR-541-3p轴能够通过调控CCDN1 或其他靶基因进而影响胃癌进展将是课题组之后重点关注的方向。