基于网络药理学和分子对接技术探讨缓哮六安煎治疗儿童支气管哮喘的作用机制

高诗宇，吴力群，马 佳，李盼盼，路 晨，聂 力

(1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)

支气管哮喘(简称哮喘)为儿童呼吸系统常见疾病，是由多种细胞及细胞组分共同参与的慢性气道炎性疾病，临床上主要分为缓解期、慢性持续期、急性发作期[1]。其中儿童哮喘的慢性持续期是疾病转归预后的关键时期，常表现为反复不同程度的喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状，严重影响儿童的身心健康及生活质量[2-3]。中医学认为，哮喘属于“哮证”“喘证”等范畴，其慢性持续期的基本病机为痰瘀互结，以健脾祛痰、温肺平喘为治法[4]。中医药在哮喘治疗中显示出独特的优势，导师吴力群教授多年来致力于小儿哮喘的治疗，于继承四川省名中医胡天成教授学术思想基础上，化裁古方六安煎，并结合数十年临床经验自拟缓哮六安煎，可明显改善哮喘症状并控制哮喘发作水平[5]。本方中以半夏燥湿化痰为君；橘红理气化痰燥湿，茯苓健脾渗湿，以绝生痰之源，共为臣药；杏仁润燥而化痰止咳，白芥子行气而化痰，海浮石软坚而消痰，瓜蒌皮清热而化痰，佐助君臣；葶苈子泻肺平喘，甘草调和诸药，地龙解痉止咳共为佐使，上述诸药共奏健脾理气、化痰通络之效。但缓哮六安煎治疗哮喘的机制尚不明确，现基于网络药理学通过构建中药复方调控网络，预测缓哮六安煎治疗哮喘的物质基础及核心靶点，从网络层面系统综合地阐述分子靶标在疾病中的作用机制，为缓哮六安煎治疗哮喘提供参考。

1 材料与方法

1.1缓哮六安煎成分靶点的获取 采用TCMSP数据库，以OB≥30%，DL≥0.18为标准获取半夏、橘红、茯苓、苦杏仁、海浮石、瓜蒌、白芥子、葶苈子及甘草的活性成分及成分靶点，通过BATMAN-TCM、NCBI、TCM-ID数据库获取海浮石及地龙的活性成分，再通过PubChem数据库获取活性成分的SMILLS机构，输入到SwissTargetPrediction数据库获取其成分靶点。将活性成分作用靶点统一在Uniprot蛋白质数据库进行标准化处理。

1.2儿童哮喘靶点的获取 以“Bronchial asthma in children”作为关键词，通过OMIM及GeneCards数据库获取儿童哮喘的有效靶点。在Genecards数据库中，分值越高则代表该靶点与疾病联系越密切，故取相关打分值≥20的靶点为儿童哮喘的潜在靶点。合并两个数据库，删除重复性后，即为儿童哮喘的靶点。再将上述得到的缓哮六安煎的成分靶点与儿童哮喘的靶点依次输入到Venny平台，得到的交集靶点即为缓哮六安煎治疗儿童哮喘靶点。

1.3成分-靶点网络的构建 将上述获取的缓哮六安煎成分靶点与交集靶点导入Cytoscape 3.7.0软件中，获取缓哮六安煎成分靶点-靶点网络。并借助Cytoscape分析软件对网络进行拓扑参数分析，网络中节点代表成分和靶点，边代表成分和靶点的关系，网络中Degree值越大表明节点越重要。最后，选取Degree值排名靠前的成分作为核心成分。

1.4PPI网络的构建 为了系统地探讨缓哮六安煎与儿童哮喘靶点间的网络协同作用，采用String数据库对交集靶点进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析，设置物种为“智人”种，最小交互打分值为0.7构建PPI网络。再将结果以TSV格式导出，借用Cytoscape分析软件对网络进行拓扑参数进行分析。选取Degree值排名靠前的靶点作为核心靶点。

1.5GO富集分析和KEGG通路分析 采用DAVID平台，设置物种为“智人”种对交集靶点进行GO富集分析和KEGG通路分析，其中GO富集分析包括生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞组成(CC)3个分支。根据Pvalue值，选取结果较好的过程和通路采用R语言进行做图分析。

1.6核心成分与核心靶点分子对接验证 将上述核心成分与靶点进行分子对接验证。将核心靶点的Uniprot ID输入RSB PDB数据库中，获取核心的晶体结构；在TCMSP数据库中下载核心靶点的mol2格式，再采用ChemDraw 3D软件进行能量最小化。采用Autodock软件对核心靶点进行去水加氢、去配体及氨基酸的修补处理并保存为PDBQT形式。最后，采用Autodock Vina软件进行对接处理，以结合能大小衡量对接结果，结合能越小代表其对接结果越好。本研究以结合能≤-5 kJ/mol表明两者具有较好的相互作用[6]。

2 结 果

2.1缓哮六安煎的活性成分及成分靶点 通过TCMSP数据库分别获得半夏13个、橘红9个、茯苓15个、苦杏仁19个、瓜蒌11个、白芥子3个、葶苈子12个及甘草92个活性成分。通过BATMAN-TCM、NCBI、TCM-ID数据库获得海浮石2个、地龙2个活性成分。剔除重复项及无靶点成分后，总共得到129个活性成分。获得成分靶点2 518个，剔除重复项后得到缓哮六安煎成分靶点592个。

2.2儿童哮喘的靶点 通过OMIM及GeneCards数据库分别获得儿童哮喘靶点689，189个，剔除重复项后得到866个儿童哮喘靶点。与缓哮六安煎成分靶点取交集，得到177个缓哮六安煎治疗儿童哮喘的靶点，见图1。

图1 缓哮六安煎与儿童支气管哮喘靶点韦恩图

2.3缓哮六安煎与儿童哮喘的成分-交集靶点网络 将上述得到的缓哮六安煎成分与交集靶点导入Cytocape中，构建成分-交集靶点网络图(见图2)。图中绿色代表活性成分，红色代表交集靶点，网络中包含306个节点和1 146条边。根据Degree值筛选得到槲皮素、山柰酚及7-甲氧基-2-甲基异黄酮等10个成分为核心成分，具体信息见表1。

表1 缓哮六安煎治疗儿童支气管哮喘的核心成分信息表

图2 缓哮六安煎与儿童支气管哮喘成分-交集靶点网络图

2.4PPI网络的构建 使用String数据库，对交集靶点进行蛋白间相互作用分析，构建PPI网络图(见图3)。网络中包含177个节点，1 447条边，平均节点16.4个。借助Cytoscape软件分析发现IL-6、TNF及EGFR等10个靶点的Degree值排名靠前，为缓哮六安煎治疗儿童哮喘的核心靶点，具体信息见表2。

表2 缓哮六安煎治疗儿童支气管哮喘的核心靶点信息表

图3 缓哮六安煎与儿童支气管哮喘交集靶点的PPI网络图

2.5GO富集分析与KEGG通路分析 通过DAVID数据库对缓哮六安煎与儿童哮喘的交集靶点进行GO富集分析发现主要涉及2 809条生物过程，包括对脂多糖、对细菌来源分子的反应及药物反应等；74个细胞组成包括膜筏、膜微区、囊泡腔；157条分子功能，包括受体配体活性、信号受体激活剂活性及DNA结合转录因子结合等，根据P值分别筛选前10条做图，见图4。KEGG通路分析得到TNF、IL-17及MAPK等178条信号通路，根据P值筛选前20条及通路做图，见图5。

图4 缓哮六安煎与儿童支气管哮喘的交集靶点GO富集分析图

图5 KEGG通路富集分析气泡图

2.6通路-靶点网络的构建 为了清晰地了解靶点在通路中的分布情况，将上述得到的前20条通路及对应的靶点导入Cytoscape中，构建通路-靶点网络图(见图6)，网络中节点的大小表示其对应的Degree值的大小。分析发现缓哮六安煎主要作用于IL-6、MAPK、AKT1等靶点，调控TNF、IL-17及MAPK等通路发挥治疗儿童哮喘的作用。本结果与上述预测的核心靶点基本一致，再次验证了PPI网分析的准确性。

图6 通路-靶点网络图

2.7分子对接验证 采用Autodock Vina对前10个核心靶点和核心成分进行分子对接验证(见图7)，结果显示其对接结合能均<-5kJ/mol，表明核心靶点和核心成分对接良好，也再次验证了网络药理学的准确性。其中quercetin与IL-6、licochalcone a与EGFR的结合能最低，分别为-9.9，-10 kJ/mol，用Pymol软件对其绘图(见图8)，由图可见quercetin与IL-6在SER，TYR，GLN，CYS，HIS，TRP形成氢键，在MET、ARG、ASN处形成氢键，因此具有较强的结合力。

图7 分子对接热图

图8 quercetin与IL-6及licochalcone a与EGFR分子对接模式图

3 讨 论

哮喘是一种持续的慢性气道炎症性疾病，其基本病理特征为气道炎症、气道黏液高分泌及气道重塑等[7]。随着环境污染及人们生活环境的改变，近年来哮喘的发病率逐年上升，目前全球约有3.34亿人受到哮喘的影响且儿童占10%[8]。哮喘的治疗目标是实现良好的控制，即最大限度地减少症状负担和加重风险，指南将吸入性糖皮质激素、长效β2受体激动剂、白三烯受体拮抗剂等列为儿童哮喘常用药物[9]。吸入性糖皮质激素是控制哮喘的首选药物，可通过改善气道慢性炎症，减轻气道黏液异常高分泌治疗哮喘，但停药后易复发；而且该药长期应用可影响儿童生长发育[10-11]，从而导致患儿家长依从性差[12]。因此为临床寻找全有效的药物迫在眉睫。

中医中药治疗儿童哮喘优势近年来受到重视，众多学者也开始研究中药复方治疗哮喘的作用机制。已有研究证实，由半夏、橘红、茯苓、苦杏仁、海浮石、瓜蒌、白芥子、葶苈子、地龙及甘草组成的缓哮六安煎在改善儿童哮喘症状及控制哮喘方面具有显著疗效[5]，但其治疗哮喘的药理作用机制尚不明确。中医药多成分、多靶点及多通路治疗疾病的模式与网络药理系统性、整体性的特点相一致，因此使用网络药理学方法探讨缓哮六安煎抗哮喘的分子机制较适宜。本研究基于网络药理学探讨缓哮六安煎抗哮喘的相关分子机制，可以为临床上扩大其应用范围及后续的研究奠定理论基础。

本研究从TCMSP、BATMAN-TCM、NCBI及TCM-ID数据库共获取缓哮六安煎的活性成分129个，通过结合药物靶点与疾病靶点信息构建“成分-交集靶点”复合网络分析发现，缓哮六安煎治疗儿童哮喘的核心成分包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇及甘草查尔酮A等。槲皮素能够调节免疫、扩张支气管而发挥抗哮喘的作用[13]。亦有研究表明，槲皮素可通过下调IL-4、IL-5和miR-155表达改善哮喘小鼠气道炎症而对哮喘具有缓解作用[14]。山柰酚及异鼠李素具有治疗哮喘及支气管炎的作用[15]。山柰酚可通过抑制过敏性哮喘小鼠的气道增生及增厚，减轻肺组织炎症反应来缓解哮喘反应[16]。异鼠李素治疗通过下调NF-κB信号通路来降低脂多糖诱导的炎症反应，参与哮喘的发生发展[17]。β-谷甾醇能够抑制TNF-α、IL-6的释放并下调NF-κB信号通路的表达而对肺组织起保护作用[18]。甘草查尔酮A可抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的气道平滑肌细胞增殖而缓解哮喘气道重塑，其作用机制可能与抑制VEGFR2和ERK1/2的活性有关[19]。

PPI网络及富集分析结果表明，缓哮六安煎可能通过IL-6、TNF及EGFR等177个靶点调控TNF、IL-17及MAPK等178条信号通路发挥治疗儿童哮喘的作用。TNF-α及IL-6为重要的炎症因子，在炎症反应和细胞免疫等多种病理过程中发挥着关键的作用。研究显示，下调IL-6和TNF-α等炎症因子水平，可减轻肺部炎症，进而改善哮喘气道高反应性及气道重塑[20-21]。通过抑制TNF信号通路能够减少炎症介质的合成，缓解气道黏液高分泌及气道重塑，发挥治疗哮喘的作用[22]。由Th17细胞分泌的IL-17与哮喘的严重程度呈正相关，其可加重气道炎症反应、促进气道黏液分泌及气道重塑，进而加重哮喘症状[23]。此外，IL-17在哮喘患者体内高表达可刺激IL-6等趋化因子的产生与募集，进而加重炎症反应[24]。EGFR是人表皮生长因子受体家族成员，为气道上皮细胞中功能的调控者，且在慢性气道炎性反应中表达呈增加趋势。下调EGFR可减少杯状细胞增生和黏液高分泌，进而减轻哮喘气道重塑[25]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号传导通路可介导炎性因子的产生，广泛参与炎症的发生发展[26]。李俊峰等[27]研究发现，通过抑制MAPK信号通路，可减少哮喘小鼠气道炎性细胞的浸润而改善哮喘气道炎症反应。以上报道结果均与本研究的预测结果相一致，说明本研究结果具有有一定可信度。通过分子对接技术，将筛选出的前10个核心靶点和核心成分进行分子对接验证，结果显示核心靶点和核心成分对接良好，进一步验证了网络药理学的准确性。

综上所述，缓哮六安煎可能通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇及甘草查尔酮A等129个活性成分作用于IL-6、TNF及EGFR等177个靶点调控TNF、IL-17及MAPK等178条信号通路对儿童哮喘起治疗作用。因此，缓哮六安煎抗哮喘的药理作用是通过多成分、多靶点及多通路的调控而实现的，其具体的作用机制需进一步的实验验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。