不同组合菌种预处理对褐煤制生物甲烷的影响

王 磊，郭红玉，赵树峰，石尚威，赵国俊

(1.山西焦煤山煤国际大平煤业有限公司，山西 长治 046200； 2.河南理工大学 能源科学与工程学院，河南 焦作 454000； 3.山西小回沟煤业有限公司，山西 太原 030400)

我国褐煤资源储量丰富，尤其是内蒙古自治区，占全国褐煤总储量的77%，其次是云南省，占全国褐煤资源储量的12.6%[1]。褐煤水分含量高、易风化，难以洗选和储存，目前以粉煤锅炉燃烧为主，也有传统的炼焦、气化和液化等处理方式[2-6]。但这些方法存在利用率低、成本较高、环境污染等问题，亟需一种清洁高效利用褐煤的方法。近年来，由于煤层气生物工程的蓬勃发展[7]，人们对微生物增产煤层气概念有了更加深入的了解，并且国内外开展了现场生物增产煤层气的许多试验，其中美国的Ciris Energy公司将营养液加入至循环水中以刺激煤层中现存细菌的生长，进而对煤炭进行降解，产生甲烷。2010年现场测试，注入营养液4个月后，煤层气井甲烷产量迅速上升，相比注入前，产量提高了2～5倍[8]。我国华北油田公司，在山西晋城郑1区块煤层气井郑1-312开展试验，煤层埋深780m，煤层温度32℃。注入配液用煤层气井排采水，2015年1月26日开始现场施工，总注入量230m3，营养剂关井反应60d后煤层产出液菌群浓度与措施前相比较增加了2～5个数量级，煤层营养物质被消耗，措施前平均日产气16.81m3，措施后平均日产气75.13m3，微生物措施起到了稳产增气的目的[9]。因此，微生物降解煤产生物甲烷，成了国内外学者研究的热点，由于其反应条件温和、绿色环保、能耗低而备受关注[10-12]。

微生物降解煤产甲烷包括水解、产酸、产氢/产乙酸、产甲烷阶段和多菌群的协同作用，而水解阶段是整个过程中的限速阶段[13]，预处理往往是解决限速阶段的重要方法之一[14]。目前对煤进行预处理的方法分为物理、化学和生物三大类。物理预处理主要采用物理方法(超声波、溶胀等)，旨在促进煤的溶解与降解过程[15，16]；化学预处理通过双氧水、硝酸和高锰酸钾等溶液打断煤大分子间的化学键，将煤的复杂大分子结构解聚成小分子，从而促进煤的转化[17，18]；生物预处理多采用细菌、放线菌、白腐菌、酵母菌等微生物对煤进行降解处理，使煤从大分子结构分解成小分子和酸类物质，从而更好地被产甲烷菌利用，实现煤的高效产气[19-22]。

由于生物预处理具有成本低、条件温和、环境污染小等特点，因此本文研究不同组合微生物处理褐煤对煤制生物甲烷的影响，对煤进行不用组合菌种的预处理，在不同组合菌种处理下研究煤的生物产气特征，并通过动力学方程模拟不同组合菌预处理煤的最大甲烷产率和累计产气潜力，以此探索提高褐煤生物产气的新方法，为后续现场试验提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验煤样

本实验煤样采自内蒙古西乌珠穆沁旗白音华矿的新鲜褐煤，采集之后迅速进行密封处理，然后使用蒸馏水进行冲洗，使用高压灭菌锅在121℃下处理20min进行灭菌，再将处理后的煤样放入60℃恒温干燥箱中，等烘干至重量不变后将煤样密封保存。实验前需将煤样破碎筛分至60～80目，采用国家标准GB/T 30732—2014和GB/T 31391—2015对煤样进行了工业分析和元素分析，分析结果见表1。

表1 内蒙古白音华褐煤样品的基本性质 %

1.2 产甲烷菌的富集培养

1)矿井水的采集。矿井水采自焦作古汉山矿新鲜的煤层水，将矿井水迅速放入容器中并使用N2进行密封，带回实验室后放入冰箱内保存，设置温度为4℃，以备后续生物产气实验使用。

2)产甲烷菌群的富集培养。产甲烷菌群的培养基见表2。将矿井水和培养基的混合液pH值调为7.0，然后装入无菌容器中，向其中充入氮气5min，完成后迅速密封并放入恒温培养箱，设置温度为35℃，然后在厌氧环境进行为期4d的发酵，得到产甲烷菌群富集液。

1.3 预处理菌种的筛选与培养

1.3.1 菌种的筛选

目前可降解煤的微生物有许多种，包括细菌(如假单孢菌、巨大芽孢杆菌)、放线菌(如链霉菌)、酵母菌、真菌(如云芝、粉状侧孢菌、假丝酵母)等，总的来说，真菌类占比较大[23-25]。为验证不同菌种的处理效果，同时满足经济性、适用性、以及无污染性等特点，实验从细菌中选取假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，从放线菌中选取绿孢链霉菌(Streptomyces viridosporus)，从真菌中选取白腐菌(Phanerochaete ch-rysosporium)作为预处理菌种。菌种源是北纳创联生物科技有限公司和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种基本信息见表3。

表2 产甲烷菌群培养基

表3 菌种基本信息

各菌种培养基的配制：

1)CM0841培养基：牛肉膏10g，酵母膏5.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，琼脂15.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，pH=7.2。

2)0038 ISP-2培养基：麦芽提取物10g，葡萄糖4g，琼脂15g，酵母提取物4g，蒸馏水1L，pH=7.3。

3)综合马铃薯培养基：葡萄糖20g，MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素0.008g，KH2PO43g，琼脂15g，20%马铃薯汁1L，pH=6。

1.3.2 菌种的活化与培养

购买菌种均为冻干管模式，存放在安瓿内并处于密封状态，该状态不能直接进行实验，需要先对其进行活化和富集，过程在固体斜面培养基上进行，在菌种活化富集完成后可进行煤样预处理实验。

培养操作：首先使用无菌吸管吸取约0.3～0.5mL的菌种对应液体培养基(不添加琼脂)，然后滴入安瓿内，轻轻振荡，直至冻干菌体溶解呈现出悬浮状；之后吸取安瓿瓶内全部菌悬液，移入对应培养试管中，首次活化成功后不能直接用于实验，在培养箱中使其再进行1～2次传代以恢复活力，之后可对煤样进行预处理。

1.4 菌种生长阶段测定

论文选择比浊法进行各个菌种生长阶段的数据测量，该方法利用微生物悬液浓度与其浑浊度成正比的特性，使用分光光度计进行各细菌悬液的光密度的测定，从而得到各菌液的浓度并绘制出生长曲线，如图1所示。

图1 菌种生长曲线

由图1可看出，假单胞菌、绿孢链霉菌和白腐菌三种菌的迟缓期为1～2d；对数期在2～3d，此时是所有菌种生长速率最快的时期；在第4～5d，菌种生长曲线有所下降；在第6d进入相对稳定期；在第15d后，菌种死亡率增加，菌种生长进入衰退期。为了提高菌种作用效果，选择培养第2d(对数期)的菌种进行预处理实验。

1.5 煤样生物预处理

实验前将使用电磁矿石粉碎机将煤样粉碎，并使用标准筛选取60～80目之间煤样，置于干燥样品袋内保存。

在超净工作台进行煤样的预处理实验，实验选用筛分至60～80目的煤样，实验前先对煤样进行灭菌处理，然后再进行干燥，之后取10g煤样放入无菌反应瓶中，向反应瓶中加入经过富集培养的菌液，使菌液淹没煤样，然后用棉塞塞住瓶口，棉塞中加入医用棉，以防止预处理实验中菌种被污染，并且使用棉塞能保证实验过程中的有氧环境。不同组合菌种预处理煤样见表4。

表4 生物预处理实验分组

1.6 气体组分含量测定

采用安捷伦7890 GC型气相色谱仪进行气体组分测定。采用进样针手动进样，每次进行体积为1mL，5A分子筛不锈钢填充色谱柱，检测温度为100℃，载气为氦气，流速为30mL/min。

1.7 气体体积测定

产气量采用排水集气法进行测量，每3 d测量一次，气体体积为集水瓶中排出水的体积。

2 产气特征分析

2.1 生物预处理对煤制生物甲烷的影响

为了研究生物预处理对煤制生物甲烷的影响，将预处理煤样与原煤样进行厌氧发酵生物产气实验，每3d测定各组煤样产气量直到无气体生成，然后用气相色谱仪对实验所产气体组分进行测定。

2.1.1 不同组合菌种预处理对产气量的影响

菌种预处理后煤样累计产气量如图2所示。对照组Y-H总产气量为151.50mL，其中甲烷产量为52.33mL，甲烷浓度为34.54%；生物预处理组J-L-H、J-B-H、L-B-H、L-J-H、B-J-H和B-L-H的总产气量分别为180.50mL、187.50mL、285.50mL、196.50mL、175.50mL、278.50mL，相比于对照组Y-H分别增长了19.14%、23.76%、88.45%、29.70%、16.23%和83.83%，各生物预处理组甲烷产量为68.50mL、96.30mL、106.49mL、89.15mL、82.71mL和118.98mL，相比于对照组分别增加了30.90%、84.02%、103.50%、70.36%、58.05%和127.36%。综上，煤样经过不同组合菌种预处理后其总产气量、甲烷生成量以及甲烷浓度比原煤样均有不同程度的提高，推测菌种在预处理过程中改变了煤的结构，使其更易向甲烷方向转化。

图2 菌种预处理后煤样累计产气量

2.1.2 不同组合菌种对阶段产气量的影响

煤样经菌种预处理后的阶段产气量如图3所示。由图3可知，煤制生物气实验中，0～6d为产气初期阶段，此时各实验组的产气速率普遍较低；6～12d为快速产气阶段，此阶段是产气量的主要来源，到第12d产气基本停止，累计产气量基本稳定，只有L-B-H组(绿孢链霉菌+白腐菌+白音华原煤)和B-L-H组(白腐菌+绿孢链霉菌+白音华原煤)还继续产气，但产气速率大幅降低；12～21d，L-B-H组和B-L-H组产气逐渐停止，到第21d，所有实验组停止产气。

图3 煤样经菌种预处理后的阶段产气量

2.1.3 不同组合菌种预处理和产气的关系

煤样经菌种预处理后产气甲烷浓度如图4所示，J-L-H组与J-B-H组相比，两组产气总量相近，但后者的甲烷生成量和产甲烷浓度更高，说明假单胞菌+白腐菌的预处理顺序比假单胞菌+绿孢链霉菌更好；L-B-H组与L-J-H组相比，前者的总产气量和甲烷生成量高于后者，但产甲烷浓度低于后者；B-J-H组和B-L-H组相比，后者的总产气量和甲烷生成量高于前者，但产甲烷浓度低于前者。

图4 煤样经菌种预处理后产气甲烷浓度

产气量较高的是L-B-H组和B-L-H组，甲烷生成量较高的也是L-B-H组和B-L-H组，但B-L-H组的甲烷浓度和甲烷生成量略高于L-B-H组；经过对比J-L-H组和L-J-H组，发现L-J-H组的产气量、甲烷生成量和产甲烷浓度都高于J-L-H组，表明绿孢链霉菌+假单胞菌的预处理顺序产气效果较好；经过对比J-B-H组和B-J-H组，发现J-B-H组的产气量、甲烷生成量和产甲烷浓度都高于B-J-H组，表明假单胞菌+白腐菌的预处理顺序产气效果较好。推测绿孢链霉菌和白腐菌对煤样预处理产气效果较好，并且加入顺序对产气总量影响不大，但先加入白腐菌比先加入绿孢链霉菌甲烷浓度高，J-B-H组的甲烷浓度最高，可达到51.36%，是原煤样所产甲烷浓度的1.49倍。

2.2 Gompertz模型产气拟合

Gompertz模型建立在特定生长率和种群密度之间的指数关系上，该模型被修改为用细菌生长期期间的指数生长率和滞后期 持续时间来描述细胞密度的函数[26]。

实验采用改进Gompertz方程进行甲烷产生的模拟，对其产生的动力学作出评估。

y=ae-e[-k(x-xc)]

(1)

将实验数据和拟合的R2值作为Gompertz方程的参数来源，见表5，拟合结果如图5所示。

表5 Gompertz方程的参数

图5 微生物预处理煤样模拟累计产气量

由表5和图5可知，Gompertz方程的拟合度较高。相比于原煤样Y-H，菌种预处理煤样的最大产气甲烷率都有不同程度的增加，J-L-H组增长29.35%，J-B-H组增长103.07%，L-B-H组增长50.77%，L-J-H组增长81.05%，B-J-H组增长64.80%，B-L-H组增长98.10%；菌种预处理煤样的累计产气潜力相比于原煤样也有一定的增加，J-L-H组增长28.88%，J-B-H组增长86.85%，L-B-H组增长108.21%，L-J-H组增长73.19%，B-J-H组增长61.67%，B-L-H组增长132.40%。由此可知，菌种预处理对煤制生物气的产生具有明显的促进作用，可推断煤样经菌种预处理后，在生物产气过程中将具有更大的最大甲烷产率和累计产气潜力。

3 结 论

1)不同菌种两两组合按照不同顺序进行预处理后，褐煤的产气效果提高且各不相同，改进的Gompertz方程拟合发现，不同菌种预处理后的褐煤将具有更大产气潜力。

2)不同类型的微生物对煤的降解机理不同，为掌握更多微生物降解转化煤炭的机理和规律，需要对降解产物的组成、理化性质等特性进行更全面的研究。