表面活性剂强化LiCl溶液灭活空调霉菌的研究

李瑞青,杨自力,谷雨倩,游雨昕,凌 晨,张敏歆

表面活性剂强化LiCl溶液灭活空调霉菌的研究

李瑞青,杨自力*,谷雨倩,游雨昕,凌 晨,张敏歆

(东华大学环境科学与工程学院,上海 201620)

以空调系统中常见的黑曲霉(.)和桔青霉(.)孢子为对象,基于单因素全面实验并结合SEM显微观察等方法,探究了添加表面活性剂(异辛醇,2-EH)对LiCl溶液灭霉的强化性能及潜在机理.结果表明:添加微量异辛醇(质量浓度为50×10-6～300 ×10-6)可大幅提高LiCl溶液的灭霉效率,且提升幅度随添加量显著增强,增幅达12.6倍;有效灭霉所必需的LiCl溶液触发浓度由40%(高浓)大幅降低至20%(低浓);异辛醇的强化灭霉作用对中低浓度LiCl溶液尤为显著,在浓度为20%的低浓度LiCl溶液中添加仅300 ×10-6g/g(即万分之三)的异辛醇,所研究霉菌孢子的灭活率从7.8%提高至近100%.SEM微观分析显示:微量异辛醇与低浓度LiCl溶液的自身灭霉能力较弱,单独作用于孢子时仅出现轻微皱缩,并无明显结构破坏,但在低浓度LiCl加入微量异辛醇后,孢子出现显著的结构破碎而灭活.研究结果可为提高溶液除湿空调灭霉能力提供新方法与依据.

霉菌；灭活；空气品质；空调系统；表面活性剂

霉菌气溶胶容易通过空调系统侵入室内[1-3],在室内适宜的环境下快速增殖,不仅引发儿童、老人罹患过敏性鼻炎、肺炎等呼吸道疾病[4-8],还会引起粮食等物资霉变[9-10].如何在空调通风系统中切断霉菌气溶胶侵入室内的路径,对保障室内人员健康与物资安全至关重要.

传统空调系统中常用表冷器冷却空气至露点温度以下的除湿方式,会不可避免地会产生、积聚冷凝水,促进霉菌在系统内滋生,加剧对送风气流的污染[11-13].相比之下,溶液除湿空调通过具有较低水蒸气分压力的吸湿溶液与空气直接接触,吸收空气中的水分而实现除湿,避免了冷凝水的产生.同时,这种溶液与空气直接接触的方式能有效捕集气流中的微生物颗粒而不产生气态副产物.更重要的是,该系统常用的除湿剂(如LiCl、LiBr、CaCl2溶液等)是无毒无害的盐水溶液,可与菌体细胞形成较大的渗透压差而使菌体脱水失活,具有一定的灭菌能力[14].在常见的除湿盐溶液中,LiCl溶液因其极佳的除湿性能、稳定无气味、密度低容易输送等优势[15-16],在溶液除湿系统中得到广泛应用.

研究者们对LiCl溶液灭活微生物气溶胶的能力进行了广泛探索.Robertson-Dwmers[17]采用接种培养法研究了LiCl溶液对金黄色葡萄球菌和黑曲霉活性的影响,发现LiCl溶液对上述菌体均具有灭活作用.而Park等[18]通过安德森采样器收集LiCl溶液除湿系统入口和出口气流中的微生物气溶胶,发现系统对霉菌气溶胶的净化效率仅为44%,远低于细菌气溶胶(81%).Wang等[19]、谷雨倩等[14]的研究进一步指出:LiCl溶液对霉菌的灭活效率随溶液浓度增加而增大,但只有浓度较高时(40%)才能有效灭活霉菌,浓度较低下(如30%)灭霉效果较差.

显然,单纯使用LiCl溶液灭活空调霉菌气溶胶目前还存在灭霉效率低、有效灭霉所需溶液浓度过大,溶液在系统内有结晶风险等问题.灭霉效率普遍较低的原因是霉菌表面的疏水蛋白[20-21]使菌体具有极强的疏水性、难以与LiCl水溶液充分接触.为此,本文提出向LiCl溶液中加入微量兼具疏水和亲水基团的表面活性剂[22],通过其疏水基团与霉菌疏水蛋白形成表面吸附,降低霉菌的疏水性,从而促进溶液与霉菌的接触以强化菌体灭活.相比于其他强化灭霉手段,该方法简单高效,且不会影响空气品质.

本文以除湿空调已成熟应用的表面活性剂异辛醇为例,以空调送风中常检测出的致敏性黑曲霉、桔青霉等孢子为对象,通过设置单因素全面实验并结合微生物培养、SEM显微观察等方法,研究添加表面活性剂前后LiCl溶液灭霉效率的变化,分析不同溶液浓度下表面活性剂对强化灭霉的影响规律,并探讨表面活性剂添加前后菌体微观结构变化及强化灭霉的潜在机理.研究结果可为进一步强化溶液除湿空调灭活霉菌气溶胶提供新方法与依据,对降低室内人员的霉菌暴露风险具有重要价值.

图1 霉菌的极强疏水性

1 材料与方法

1.1 表面活性剂选择与添加量

选择溶液除湿空调应用最广泛[23]的表面活性剂异辛醇(即2-乙基己醇,2-EH),一种无色澄清的液体.联合国发布的《全球化学品统一分类和标签制度》(即GHS制度)[24]将2-EH的毒性定为第5级(最低级),弱于LiCl(第4级),与LiCl同属于低毒类物质.虽然2-EH具有一定的挥发性,但在实际应用添加时极为微量,常为百万分之一(×10-6)数量级[25-26], 2-EH在常温下(20℃)的溶解度约为1000×10-6g/g,因此微量添加不会明显影响所处理空气的品质.为初步明确2-EH对强化除湿溶液灭霉性能的有效性及添加范围,本文选取50×10-6、100×10-6、300×10-6等3种微量质量浓度.

1.2 菌种选择与孢子悬液制备

本文选取在空调送风中常被检出的致敏性曲霉菌、青霉菌[2]的代表菌种——黑曲霉(.)和桔青霉(.)孢子为研究对象,实验用二代斜面菌株黑曲霉(CMCC(F)98003)和桔青霉(ATCC1109),均购自上海鲁微科技有限公司,按如下步骤制备菌液:将所购斜面菌株分别转接涂布于预制的PDA(购自青岛高科园海博生物技术有限公司)固体培养基表面,随后置于霉菌培养箱(SPX/MJX系列,上海力辰仪器)内28℃下恒温培养3～5d,待培养基上长满菌落后,将培养基置于超净工作台(SW-CJ-1D型,苏州净化设备公司)内,向其中缓缓加入20mL无菌蒸馏水,并用灭菌接种环在表面轻轻刮动将菌落表面孢子洗脱.为去除洗脱过程中夹带的菌丝,将脱脂棉附于50mL离心管口过滤洗脱液,得到较纯的孢子悬液,随后在离心机(湘仪H1850)内离心7min(离心转速:7000r/min);离心后弃去上清液,所得孢子中再加入无菌蒸馏水,重悬后再离心.重复两次后将所得孢子与无菌蒸馏水混合稀释配成孢子悬液,取样并滴于计数板后在显微镜(CX23, Olympus,´400)下计数,调整稀释比例直至孢子悬液浓度约为106CFU/mL,待用.

1.3 LiCl溶液制备

选取溶液除湿空调中的常用工质——LiCl溶液开展研究.LiCl除湿能力强,但当浓度大于40%时容易在常温下结晶[16],因此实际应用中其浓度不宜超过40%.为探究微量2-EH对不同浓度LiCl溶液灭霉性能的影响(特别是低浓度下),本文制备了质量分数为10%、20%、30%、40%的LiCl水溶液,分别作为低浓组(10%、20%)、中低浓组(30%)和高浓组(40%).制备LiCl溶液时,采用电子天平(0.01g, FA1004型,邦西仪器科技有限公司)称取粉末状的分析纯LiCl溶质(纯度³99.9%),缓慢加入盛有无菌蒸馏水的烧杯内,迅速搅拌直至完全溶解,冷却至室温后待用.

1.4 实验工况及方法

为探究各2-EH添加量对不同浓度LiCl溶液灭活霉菌孢子的影响,采用单因素全面实验法,两种霉菌共有研究工况40组,每组工况独立重复3次,共开展实验120次,实验工况水平如表1所示.由于实验所选黑曲霉和桔青霉孢子易长成为菌落,且培养所需时间较短,采用应用最广泛的平板菌落计数法确定各条件下的存活孢子数.

主要实验过程如下:首先在室温下分别取4.5mL已制备好的不同目标浓度的LiCl溶液(如表1)于试管中,以添加2-EH后的混合溶液为基准,提前换算各实验工况所需目标2-EH添加量,用微量移液器(量程为0.1～2.5μL)准确吸取所需2-EH(分析纯,纯度³99.0%,购自天津市科密欧化学试剂有限公司)并分别加至盛有不同浓度LiCl溶液的试管中,振荡混合均匀.紧接着用滴管吸取0.5mL的孢子悬液,滴加至装有2-EH和LiCl混合溶液的试管中,振荡使其混合均匀.由于除湿溶液在实际系统内循环时也会与所捕集的霉菌保持接触,本文实验中霉菌孢子与溶液的暴露时长设为15min.暴露后即取1mL上述混合液,梯度稀释至10-4后取100μL稀释溶液接种于PDA固体培养基并涂布均匀,随后迅速置于培养箱内在28℃下恒温培养.为避免菌落在培养基上生长密度过大导致无法准确计数,培养2.5～3d(此时菌落全部长出,且单个菌落容易辨识)后开始拍照并记录培养皿中菌落数.以上过程独立重复3次.

表1 实验工况水平

1.5 灭活效果分析指标

统计每组实验得到的菌落数作为各实验条件下存活菌体数,以原始菌液的活菌数为空白对照组,依据式(1)计算霉菌孢子灭活效率,以评判添加微量2-EH对LiCl灭活霉菌孢子的强化效果[27],所得结果均由3次独立重复实验(平均值±标准偏差)表示.

=(0-N)/0(1)

式中:为霉菌孢子灭活率,%;0为空白对照组菌落数,CFU/皿;N为实验组菌落数,CFU/皿.

2 结果与讨论

2.1 2-EH对LiCl溶液灭活霉菌的强化

2.1.1 对灭活黑曲霉(.)孢子的强化 图2给出了添加微量(50´10-6～300´10-6g/g)2-EH后各浓度LiCl溶液对黑曲霉孢子活性的影响.由图2(a～b)可见,与纯LiCl溶液相比,添加2-EH后各实验样本中活性菌落数均明显减少,且减少趋势随2-EH添加量的增加而增加.这说明从低到高浓度LiCl溶液下,2-EH均具有强化灭活黑曲霉孢子的作用,且强化效果随2-EH添加量的增加而增大.相比于原始菌液(空白对照组,(81±2) CFU/皿),低浓度LiCl溶液(20%)作用后仍有(75±12) CFU/皿的黑曲霉孢子保有活性,未实现有效灭活;但向其中添加仅50´10-6g/g(十万分之五)的微量2-EH时,其活菌数从(75±12)CFU/皿迅速降为(49±7)CFU/皿;当提高2- EH添加量至100´10-6g/g时,活菌数进一步大幅减少,仅为(4±3) CFU/皿.

虽然单独将2-EH加入至黑曲霉纯菌液中,活性菌落数也有所减少,但非常有限.这说明2-EH自身对黑曲霉的影响有限[28],远低于2-EH与LiCl溶液的协同作用.如图2(b)中单独加入50´10-6g/g的2-EH,活性菌落数为(62±4) CFU/皿,但在30%的LiCl溶液中加入50´10-6g/g的2-EH,黑曲霉孢子全部被灭活(活性菌落数为0CFU/皿).这表明2-EH强化灭霉主要为与LiCl溶液的协同作用,而非2-EH自身的有限影响.

图2(c)为不同2-EH添加量下各浓度LiCl灭活黑曲霉的效率变化规律.单纯的中低浓度LiCl溶液(如质量分数<30%)对黑曲霉灭活率十分有限,不足20%,这与文献[29]所得结果相似.而添加2-EH后灭活率均快速上升,当添加仅100´10-6g/g(万分之一) 2-EH至20%的低浓LiCl溶液中,其灭活效率接近100%,与40%高浓LiCl溶液的灭活率相近.而当提升LiCl溶液浓度至30%时,提高其灭活率所需2-EH添加量则更为微小,仅需50´10-6g/g就可将黑曲霉全部灭活.由此可见,2-EH对中低浓度LiCl溶液灭活黑曲霉的强化效果十分明显,微量添加后可接近完全灭活,本研究中2-EH的添加量为50´10-6g/g时,对10%低浓LiCl灭活黑曲霉的效率提升8倍,对30% LiCl的提升幅度为5.4倍;由于高浓(如40%)LiCl溶液自身对黑曲霉就有较强的灭活率,此时2-EH的强化效果未得到充分体现.添加微量2-EH对各浓度LiCl溶液灭活黑曲霉孢子的强化幅度可汇总如表2.

表2 2-EH添加量对各浓度LiCl溶液灭活黑曲霉效率的提升幅度(%)

注:表中括号内为纯LiCl溶液对黑曲霉的灭活率,作为灭活率提升的比较基准.

2.1.2 对灭活桔青霉(.)孢子的强化 图3(a～b)给出了添加微量2-EH前后各浓度LiCl溶液对桔青霉孢子的活性影响.与黑曲霉不同的是,由于桔青霉具有一定的耐盐性[30],LiCl溶液处于低浓度(如10%与20%)时对桔青霉孢子无灭活作用.但添加微量2-EH至同一浓度的LiCl溶液后,其中的活性菌落数明显减少且随2-EH添加量的增大而趋于显著.这说明2-EH与LiCl溶液协同作用下对桔青霉孢子具有较强的灭活作用,且随2-EH添加量的增加而进一步增强.例如浓度为20%的LiCl溶液添加50´10-6g/g 2-EH后,其中活菌数从(195±13) CFU/皿降为(168±21) CFU/皿,而提高2-EH的添加量至100´10-6g/g时,活菌数大幅降至(4±2) CFU/皿,灭活强化效果尤为显著.值得注意的是:若将2-EH单独加入至桔青霉纯菌液,其活菌数相比原菌液反而变多,这与Ida等[31]所观察结果相似,这一方面可能是由于单独加入表面活性剂促进了桔青霉孢子与培养基内营养物质的接触与获取,另一方面表面活性剂会增加桔青霉孢子内酶活性,从而促进了孢子生长.

图3(c)所示为不同2-EH添加量下各浓度LiCl灭活桔青霉效率的变化规律.由图可知,各浓度LiCl溶液对桔青霉孢子的灭活率随2-EH的添加量增加而快速上升.在20% LiCl溶液中添加100´10-6g/g 2-EH后,灭活率迅速提升至97.2%;单纯的30% LiCl溶液对桔青霉孢子的灭活作用极为有限,灭活率仅约31.2%(如表3所示),而当添加100´10-6g/g 2-EH后,孢子全部被灭活,灭活率提升2.2倍,与40%的高浓LiCl溶液的灭活效果相同.添加微量2-EH对LiCl溶液灭活桔青霉具有显著的强化作用,该强化效果对中低浓度的LiCl溶液尤为显著.

以上实验结果表明:低浓度LiCl溶液对霉菌灭活效果微弱,只有高浓度的LiCl溶液(40%)才有效灭活霉菌,这与Robertson-Dwmers[17]及谷雨倩等[14]的研究结论一致.主要原因是霉菌的细胞壁/膜对菌体有较强的保护作用,对外界环境的抗逆性较强,可有效抵抗盐溶液的高渗胁迫作用.Bang等[32]进一步在除湿段后加紫外线处理段以提高空调系统的灭霉能力,但发现经过3h的紫外处理后,霉菌灭活率也仅为5.7%.武艳[29]通过微波辐射处理霉菌,由于微波辐射波长较长,具有更好的穿透性,霉菌的灭活率可提高到70%,但此类方法需要在空调系统内额外增加处理段、增大了系统的成本与复杂性.与上述技术相比,通过添加2-EH可对LiCl灭活霉菌起到明显的促进作用.仅添加100×10-6g/g(万分之一)的2-EH时,LiCl溶液对霉菌的灭活率即接近100%.该方法在实用性及经济性等方面都表现出了较大的潜力.

表3 2-EH添加量对各浓度LiCl溶液灭活桔青霉效率的提升幅度(%)

注:1.表中括号内为纯LiCl溶液对桔青霉的灭活率,作为灭活率提升的比较基准; 2.因浓度为10%和20%的LiCl溶液单独作用时无灭活,故不列出其灭活率提升幅度(-).

2.2 强化灭活的潜在机理

上述实验结果表明,添加微量(50´10-6～300´10-6g/g)2-EH可有效强化LiCl溶液对黑曲霉和桔青霉等霉菌的灭活能力.为进一步探究其强化灭活的潜在机理,以黑曲霉孢子为例,将其短时(15min)暴露于以下3种对照溶液:300×10-6g/g 2-EH; 20% LiCl; 20% LiCl+300×10-6g/g 2-EH,通过扫描电镜(SEM, SU8010,Hitachi)观察各溶液作用前后菌体的形态结构变化,结果如图4所示.

由图4可见,未经各溶液条件作用的原始霉菌孢子,其表面光滑、结构完整、呈规则球形;当孢子经20%的LiCl溶液作用后,其表面皱缩、菌体周围出现外泄物,这是由于在LiCl盐溶液中,霉菌孢子在盐溶液的高渗胁迫[33]以及Li+对自由水极强的亲和力而使菌体细胞蛋白脱水变性[34-35]等共同作用下,导致菌体细胞膜出现损坏及胞内物质泄漏,如图4(a)所示.但由于霉菌孢子极强的疏水性,LiCl溶液无法充分与孢子表面作用,只能使部分霉菌孢子受损,大多数孢子仍可保持完整形态,佐证了图2中低浓LiCl溶液对黑曲霉的灭活作用有限;当在微量(300´10-6g/g)2-EH中暴露相同时间后,虽然部分孢子表面出现轻微的皱缩和凹陷,但大部分孢子形态仍保持完整,如图4(b),微量2-EH对黑曲霉孢子的活性影响十分有限,这与图2(b)中单独将2-EH作用于黑曲霉时其活性变化结果相吻合;但当在低浓LiCl溶液中添加300´10-6g/g 2-EH后,如图4(c)所示,霉菌孢子立刻出现大面积的损坏与结构性破碎,胞内物质几乎全部外泄,大部分菌体孢子被灭活.由于LiCl溶液与2-EH未发生化学反应或产生新的物质,导致孢子大面积灭活的原因一方面可能是溶于LiCl溶液的表面活性剂(2-EH)其疏水基团与霉菌表面疏水蛋白吸附结合,增强了霉菌孢子与LiCl溶液的混溶,使二者充分接触,从而强化了LiCl溶液的灭霉效果;另一方面,已有文献表明醇类物质会使细胞膜的通透性增大[36],这使溶液中的Li+、Cl-得以进一步渗入菌体细胞内部,从而促进灭活.但因篇幅所限,相关机理仍需进一步探究.此外,本文明确了表面活性剂对LiCl除湿溶液灭活霉菌的显著强化效果及相应添加浓度范围,但高效灭菌所需的除湿溶液与2-EH的最优协同浓度与详细配比方案等,需进一步深入探讨确定.

图4 黑曲霉孢子在各条件作用前后的微观结构变化

(a) LiCl单独作用; (b) 2-EH表面活性剂单独作用; (c) LiCl与2-EH协同作用

3 结论

3.1 添加微量2-EH(50´10-6～300´10-6g/g)可大幅提高溶液除湿空调中LiCl溶液灭活霉菌气溶胶的效率,且灭霉效率提升幅度随2-EH添加量显著增强.

3.2 2-EH的强化灭霉作用对中低浓度LiCl溶液尤为显著.在20%的低浓LiCl溶液中仅添加300× 10-6g/g(即万分之三)的2-EH,黑曲霉的灭活率从7.8%提高至100%.

3.3 添加微量(300´10-6g/g)2-EH后,溶液除湿空调有效灭霉所必需的LiCl溶液触发浓度由40%大幅降至20%.

3.4 微量2-EH和低浓LiCl协同作用下,霉菌孢子结构被严重破坏,胞内物质大面积外泄.

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Study of minor 2-EH surfactant on promoting LiCl liquid desiccant to inactivate mold in air-conditioning systems.

LI Rui-qing, YANG Zi-li*, GU Yu-qian, YOU Yu-xin, LING Chen, ZHANG Min-xin

(College of Environmental Science and Engineering, Donghua University, Shanghai 201620, China)., 2022,42(7)：3443～3449

Effects of minor 2-EH (2-ethyl-1-hexanol) surfactant on improving the inactivation ability of LiCl liquid desiccant on two species of resistant mold spores in air conditioning systems,.and.were studied. The results showed that minor addition of 2-EH (50´10-6～300×10-6) substantially enhanced the mold inactivation performance of LiCl liquid desiccant with an efficiency improvement of 12.6 fold. By adding only 300×10-6of 2-EH, the.spores were effectively inactivated (with efficacy of around 100%) by the dilute LiCl aqueous solution (20% mass concentration) instead of the concentrated 40% LiCl solution. The improvement was particularly significant for the dilute LiCl solution, which considerably reduced the essential solution concentration for effective mold inactivation. SEM analysis showed that the addition of minor 2-EH accelerates the cell structure damage and collapse of the mold spores exposed in the LiCl solution. The results may significantly improve the mold inactivation performance of the LiCl liquid desiccant air-conditioning system and reduce the risks of mold aerosol transmission.

mold；inactivation；indoor air quality；air-conditioning system；surfactant

X172,TU834

A

1000-6923(2022)07-3443-07

李瑞青(1997-),女,山西忻州人,东华大学硕士研究生,主要从事室内空气品质的研究.发表论文1篇.

2021-12-06

国家自然科学基金资助项目(52008078);上海市科技英才扬帆计划项目(19YF1401800)

* 责任作者, 副教授, ziliy@dhu.edu.cn