基于拉曼光谱的鸡蛋新鲜度检测及分类方法

谭航彬,姜 丽,金尚忠,2,徐 睿,李伊凡,于自珍,蒋彩铃

(1.中国计量大学 光学与电子科技学院,浙江 杭州 310018;2.中国计量大学光学与电子科技学院 浙江省现代计量测试技术及仪器重点实验室,浙江 杭州 310018)

鸡蛋作为人们日常饮食中必不可少的食物,其营养丰富,价格低廉,深受广大人民群众的喜爱。根据2020—2021年中国鸡蛋市场年度报告,2021年中国鸡蛋产量为1 890万吨,同比增长1.48%。然而,随着储存时间的增加,鸡蛋非常容易腐败变质。变质鸡蛋不仅降低了营养价值,而且给消费者带来了物质和经济上的损失[1]。因此,在鸡蛋的加工、运输和销售过程中对变质蛋进行检测,可以降低鸡蛋的加工成本和运输成本,降低人们购买变质蛋的风险。

近年来,由于科学技术的发展,越来越多的方法被用来检测鸡蛋的新鲜度。Dong等提出利用光纤探针采集鸡蛋赤道区近红外光谱,利用PLSR建立预测模型评价鸡蛋新鲜度[2-3]。基于拉曼散射原理的拉曼光谱检测技术由于具有快捷、灵敏、无损等特点,也被用于食品质量领域的检测研究[4]。Liu等提出了Raman光谱法,利用蛋壳表皮的拉曼光谱和鸡蛋新鲜度参数建立预测模型来评价鸡蛋质量[5]。Akbarzadeh等开发了一种基于波导和网络分析仪的微波光谱法,用于无损预测几种鸡蛋新鲜度指标[6]。Yao等提出了一种基于VIS-NIR-HSI实现鸡蛋哈夫单位分类的方案[7]。Freni等人利用脉冲热模拟反射提出了一种基于主动热成像的鸡蛋新鲜度评价方法[8]。这些方法虽然可以无损检测蛋壳,但会受到蛋壳的影响。壳上附着的杂质和微生物可能会影响壳蛋的检测光谱,从而影响检测的准确性。

本文以鸡蛋作为研究对象,利用拉曼光谱仪采集0～40 d的鸡蛋蛋黄和蛋清拉曼光谱,并通过PCA-LDA和OPLS-LDA模型进行分类,证明了拉曼光谱分析对鸡蛋新鲜度分类鉴别的可行性。

1 实验材料及仪器

同一种类的新鲜鸡蛋120枚(购买自正大蛋业有限公司,每一枚鸡蛋上都印有鸡蛋的生产日期2021年6月15日)。

在检测鸡蛋的物理指标过程中,主要用到了以下仪器和材料:超声波清洗仪、超声波清洗剂、无菌培养皿、剪刀、无水乙醇、游标卡尺。

在拉曼光谱检测的过程中,主要用到了产于法国公司Horiba的显微共聚焦拉曼光谱仪,其型号是LabBAM HR Evolution。

2 鸡蛋新鲜度检测

本实验将120枚新鲜鸡蛋统一放在常温、无光照、湿度合适的环境保存,每天取3枚鸡蛋进行新鲜度物理指标和拉曼光谱的检测,持续检测40 d。在本实验中,为了确保实验的准确性,我们每次对实验器材进行消毒清洁。首先用超声波清洗仪超声10 min,然后再用无水乙醇超声清洗10 min,最后将实验器材放到干燥箱中干燥。

2.1 鸡蛋新鲜度物理指标检测

鸡蛋新鲜度是检测和评价鸡蛋新鲜程度的指标,主要参数包括哈夫单位、气室的大小、蛋白和pH值、蛋黄指数、以及蛋黄膜的强度,壳的强度和厚度[9-13]。本实验对鸡蛋的哈夫单位、蛋黄指数、气室直径和高度进行了检测。

2.1.1 哈夫单位的测定

哈夫单位值HU(Haugh Unit)是美国农业部蛋品标准规定的检验和表示蛋品新鲜度的指标,新鲜蛋哈夫单位在72以上,72以下是不新鲜鸡蛋,不可食用。哈夫单位计算公式:

HU=100×lg(h+7.57-1.7×m0.37)。

(1)

式(1)中:HU是哈夫单位;h是蛋清的高度,mm;m是整个鸡蛋的质量,g[14]。

本文对整个鸡蛋称量3次取平均值。随后将鸡蛋打破,让蛋清和蛋黄摊开在水平台面上,用游标卡尺测量蛋清高度,取蛋清三处不同的地方测量其高度取平均值。最后根据式(1)计算HU。图1(a)为0～40 d内鸡蛋哈夫单位随时间的变化关系。

2.1.2 蛋黄指数的测定

蛋黄指数YI(Yolk Index)是指蛋黄高度与蛋黄直径的比值,可以用来表示鸡蛋的新鲜度,存放时间越短(越新鲜)的鸡蛋,蛋黄指数越大,一级蛋蛋黄指数≥0.40,二级蛋蛋黄指数≥0.36,三级蛋蛋黄指数≤0.35。计算公式为

YI=h/Φ。

(2)

式(2)中:YI是蛋黄指数;h是蛋黄高度,mm;Φ是蛋黄直径,mm[14]。

本实验将鸡蛋打破,平摊在水平台面上,取蛋黄上的三处不同位置分别用游标卡尺测量其高度,然后取平均值。同时从三个不同方向测量蛋黄的直径,这三条直径都经过一个圆心,然后取平均值,最后根据式(2)计算出鸡蛋的蛋黄指数。图1(b)为0～40 d内鸡蛋蛋黄指数随时间的变化关系。

2.1.3 气室直径和高度的测定

在鸡蛋的内部有一个蛋壳和鸡蛋膜相互脱离的地方,名叫气室。气室的大小可以用来衡量鸡蛋的新鲜度。一般通过检测气室直径和气室高度来分析气室大小。

本文用剪刀小心的将蛋壳的其余部分剪掉,只保留蛋壳的气室,然后用游标卡尺从三个方向测量气室的直径和高度,随后取平均值,得到蛋壳气室直径和气室高度。如图1(c)(d)为0～40 d内鸡蛋气室高度和直径随时间变化关系。

图1 鸡蛋新鲜度指标随时间变化关系图

2.2 鸡蛋拉曼光谱检测及数据分析

在检测完鸡蛋的哈夫单位等新鲜度物理指标后,将鸡蛋放入事先消毒清洁并且烘干的培养皿中,然后检测蛋黄和蛋清的拉曼光谱。

2.2.1 拉曼光谱检测

在采集鸡蛋的拉曼光谱之前,要先利用单晶硅片对LabBAM HR Evolution型显微共聚焦拉曼光谱仪进行校准。在实验中,检测鸡蛋用的是10×长焦物镜,选用了波长为532 nm的激发光,600 gr/mm的全息光栅,拉曼光谱的采集范围设置在0～1 800 cm-1这个区间,积分次数是5次,积分时间为10 s。每一组样品的蛋黄拉曼光谱和蛋清拉曼光谱都在3个不同样品点上采集,对原始光谱进行预处理后用于分类分析。

2.2.2 光谱的预处理

为了最大限度地确保光谱信息的可靠性,减少干扰因素对分析结果的影响。在本实验中采用LabSpec软件对采集到的鸡蛋光谱进行了去基线、平滑和平均光谱处理这三种预处理方法。

如图2(a)(b),通过采用背底线型线段组合的方式进行去基线处理,将这些线段不断循环最小二乘拟合直到拟合成水平基线为止。由于白噪声的存在,使得到的光谱的信噪比降低,因此平滑处理是光谱预处理环节的重要步骤。如图2(c)(d)所示,平滑之后的光谱图特征峰更加明显,白噪声被消除,光谱信噪比得到提高,光谱质量得到极大的改善,这对于后面的光谱分析更加有利。

最后进行平均光谱处理。通过对采集到的同一个样品的蛋清和蛋黄的多条光谱取平均,可以极大地减小因为蛋清和蛋黄分布不均匀所导致的检测差异。在对同一样品的3条蛋黄拉曼光谱和3条蛋清拉曼光谱进行平滑处理和去基线处理之后,求其平均光谱。如图2(e)(f)分别对比储存了1天的鸡蛋蛋清的3条拉曼光谱以及平均光谱。

图2 蛋清拉曼光谱预处理

2.2.3 PCA-LDA模型

主成分分析法(PCA)是一种面对多个数据指标时,通过找到各个指标之间的相互关系,以一个或者几个主要的指标来对事件进行分析筛选的数据统计方法[15]。

正交矫正的偏最小二乘分析(OPLS)，是一种适用于样本内部存在多种数量的对应关系和影响因子或者样本数量远小于被研究的影响因子数量的多元统计方法。OPLS也属于偏最小二乘分析方法,能够将自变量和应变量同时进行主成分分解。

线性判别分析(LDA)作为一种线性学习方法,在数据分析中也是特征降维的工具,且是一种有监督的降维方式[16]。其原理是如果每个数据点都有各自的标签,根据带标签的数据点,通过投影的方式,将数据点投影到维度相较于之前更低的空间当中去,并进行进一步的分类区分,相同类型的数据点会在低维度的空间中相互靠近,不同类型的点在投影后就会分离。

3 鸡蛋拉曼光谱分析及分类

3.1 蛋黄和蛋清的平均拉曼光谱

图3(a)和(c)分别是鸡蛋蛋黄和蛋清在0～40 d内的拉曼光谱图。由于拉曼光谱的数量较多且相邻几天的鸡蛋蛋黄拉曼光谱的强度变化较小,因此本实验分别选取了7个不同储存时间的鸡蛋样品平均拉曼光谱,图中的a、b、c、d、e、f和g分别是储存了0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和40 d的鸡蛋蛋液平均拉曼光谱图。从图3(a)和(c)中可以观察到随着储存时间的增加,蛋黄和蛋清拉曼光谱的几处特征峰没有发生偏移,但是这些拉曼峰的拉曼强度却在逐渐减弱,这说明随着储存时间的增加,鸡蛋内部营养物质在逐渐发生变化,导致这一变化的原因一部分是由于鸡蛋自身的呼吸作用消耗了一些营养,导致鸡蛋蛋黄的拉曼强度发生变化,还有部分原因是随着时间的增长,鸡蛋内部细菌等微生物的繁殖,使得鸡蛋营养物质减少从而导致拉曼光谱的强度降低[17]。

为了更直观的表现蛋黄和蛋清在40 d内的拉曼光谱强度的变化,以蛋黄拉曼光谱1 156 cm-1处和蛋清光谱1 004 cm-1处的特征峰的拉曼强度作为研究对象,做了图3(b)和(d)。从图3(b)和(d)中可以发现在这40 d中蛋黄和蛋清的拉曼光谱的光谱强度均是逐渐减小的。通过查阅拉曼光谱的谱峰归属,知道1 004 cm-1峰位对应的振动模式是s(C-C),rb(C-C),对应的物质是苯丙氨酸;1 156 cm-1是对应的化学键是C—H,对应多种氨基酸;1 447 cm-1峰位对应的振动模式是bυ(CH2),对应的物质是胶原蛋白[18-22]。当鸡蛋中的氨基酸由于自身代谢和细菌的分解导致含量减低时,拉曼光谱的几处特征峰的强度也相应降低。

3.2 新鲜与不新鲜鸡蛋分类

本实验采用PCA-LDA和OPLS-LDA模型对采集到的蛋黄和蛋清光谱进行分类,通过该模型实现基于拉曼光谱法的鸡蛋的新鲜与否分类鉴别。

图3 蛋黄和蛋清拉曼光谱随时间变化关系图

通过检测鸡蛋的物理新鲜度指标(哈夫单位、蛋黄指数、气室直径和宽度)将鸡蛋分为新鲜和不新鲜两类。200份拉曼光谱样本分成了80份新鲜鸡蛋样本光谱(其中包括40份新鲜蛋黄和40份新鲜蛋清)和120份不新鲜鸡蛋样本光谱(其中包括40份不新鲜蛋黄和80份不新鲜蛋清)。

图4(a)到(d)分别是基于PCA-LDA和OPLS-LDA模型的蛋黄和蛋清光谱分类得分图。图中红色圆点代表新鲜鸡蛋的拉曼光谱,蓝色三角点代表不新鲜鸡蛋的拉曼光谱,椭圆为95%置信区间。从图中可以发现,基于PCA-LDA鉴别模型对蛋黄和蛋清输入光谱进行分类的结果比OPLS-LDA模型更理想,处于95%的置信区间之外的点更少。通过比较图4(a)和(c)可以明显发现PCA-LDA模型对蛋黄的光谱的分类效果明显比OPLS-LDA模型好,图4(a)中新鲜蛋黄和不新鲜蛋黄的有较明显的分类,代表新鲜蛋黄的红色圆点全部分布于蓝色三角点的左边,两类光谱在分布上几乎没有重叠,仅4个点重叠在一起。而图4(c)中新鲜蛋黄和不新鲜蛋黄的光谱没有明显的分类,两者之间具有大面积的重叠区域,且处于95%置信区间之外的点更多。

图4 基于PCA-LDA和OPLS-LDA分类模型对蛋黄和蛋清拉曼光谱分类图

为了对鸡蛋拉曼光谱进行更好的分类,我们将得到的200张拉曼光谱进行求二阶导数处理,然后将得到的二阶导数光谱作为输入量,并对比其分类结果。

如图5(a)到(d)分别是基于PCA-LDA和OPLS-LDA模型的蛋黄蛋清二阶导光谱分类得分图。图中圆点代表新鲜鸡蛋的蛋清光谱,三角点代表不新鲜鸡蛋的蛋清光谱,椭圆为95%置信区间。从图中可以发现,相较于原始光谱,二阶导光谱在PCA-LDA和OPLS-LDA两种模型中的分类效果更加理想,对两类蛋清光谱有明显的区分,圆点全部位于三角点的左边,得分图中新鲜与不新鲜的光谱没有重叠区域,而且处于95%的置信区间之外的点也比原始光谱更少,因此PCA-LDA和OPLS-LDA模型对鸡蛋二阶导光谱具有很好的分类效果。

图5 基于PCA-LDA和OPLS-LDA分类模型对蛋黄和蛋清二阶导光谱分类图

为了进一步验证两种模型对鸡蛋样品的新鲜度识别能力,本实验还采用了留一法交叉验证的方法对这两种分类模型进行准确率的检测。将单个鸡蛋的拉曼光谱作为测试数据,将其余拉曼光谱作为分类器的训练数据,并对每个样品光谱进行验证。最后得到PCA-LDA对蛋黄和蛋清分类的准确率为96.3%和96.7%,OPLS-LDA对蛋黄和蛋清分类的准确率为98.6%和99.2%。由此可得OPLS-LDA模型对蛋黄和蛋清二阶导光谱分类效果最佳。

4 结 语

本论文首先检测鸡蛋的新鲜度物理指标:哈夫单位、蛋黄指数、蛋壳气室直径和高度。然后通过这些新鲜度物理指标将200个鸡蛋样本光谱分为80张新鲜鸡蛋光谱和120张不新鲜鸡蛋光谱(其中新鲜鸡蛋蛋黄平均光谱40张,新鲜鸡蛋蛋清40张,不新鲜鸡蛋蛋黄40张,不新鲜鸡蛋蛋清80张)。然后分别将蛋黄和蛋清的拉曼光谱和二阶导光谱输入到PCA-LDA和OPLS-LDA模型中。OPLS-LDA模型对蛋黄和蛋清二阶导拉曼光谱的分类效果最佳,准确率分别达到了98.6%和99.2%。综上,基于拉曼光谱技术能够实现对鸡蛋新鲜程度的快速检测。