黄精内生细菌的分离及鉴定

蔡文斌，刘秀丽，黄 娟，赵文娟

（陇东学院生命科学与技术学院/甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室，甘肃 庆阳 745000）

鸡头黄精（Polygonatum sibiricum）是百合科黄精属（PolygonatumMill.）多年生草本植物。黄精主要药物化学成分是黄精多糖、甾体皂苷、黄酮等［1］，药理作用主要为保护心脏、降血糖血脂、提高免疫力、保护心血管、延缓衰老、消炎抗病毒、抗肿瘤等［2］。黄精作为一种重要的药食同源植物，因其市场需求量越来越大，价格不断上涨，山区人民加大对野生黄精的采挖，致使其产量降低，处于供不应求的状态。尽管在政府的支持下，中药材种植业逐渐发展壮大，但黄精种植困难重重［3］，产量依然低下。因此若能找到一种与黄精同效且易获得的替代物，将具有重大意义，为黄精内生菌的发现提供了新思路。

内生菌普遍存在于健康植物组织中，与植物共生，能产生与植物相同或相似的代谢产物。药用植物内生菌种类丰富，代谢产物多样，主要有生物碱、皂苷类、萜类、芳香类、多肽类等化合物。孙红敏等［4］从蛇足石杉分离到可抗菌、抗病毒的内生菌；赵明等［5］从华重楼中分离到能产生重楼甾体皂苷成分的内生细菌，而重楼甾体皂苷在抗肿瘤方面有重要的作用；曲红光等［6］从人参内生细菌代谢产物中检测到了具有抗肿瘤活性的物质。郭晓平等［7］从泰山黄精块茎组织分离到一株具有广谱抗菌活性的内生细菌；柏晓辉等［8］从黄山野生黄精的根茎组织中筛选到一株具有抑菌活性的内生细菌；迟惠荣等［9］从多花黄精的根、茎、叶内分离到对尖孢镰刀菌具有拮抗作用的菌株。因此，药用植物产活性成分内生菌的分离鉴定及有药用价值代谢产物的开发，用来弥补天然中药材短缺问题不失为一种有效的途径。

本研究以陇东子午岭自然保护区多年生野生鸡头黄精为材料，从中分离出具有抑菌活性的内生细菌，并筛选遗传稳定、多糖含量高的优质菌株，通过分子生物学手段进行种属鉴定分析，力求为陇东地区黄精内生菌的开发与利用提供理论基础，同时也为野生中药材的保护及替代资源的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 试验用鸡头黄精采自陇东地区子午岭自然保护区，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由庆阳市疾控中心实验室提供并于陇东学院生命科学与技术学院微生物实验室保存。

1.1.2 试验仪器 System 9700型PCR（美国ABI公司），SIGMA3K30型冷冻离心机（德国SIGMA公司），SW-CJ-ID型超净工作台（上海苏净实业有限公司），隔水式恒温培养箱、BPG-9140A型精密鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），LDZX-30KBS型立式高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），BSD-100型振荡培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），MDF-U3386S型三洋超低温保存箱（日本三洋有限公司）。

1.1.3 试验试剂 蛋白胨、酵母提取物、无水乙醇、无水葡萄糖、牛肉膏、十二烷基磺酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等试剂均为国产分析纯，2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、小量DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）、限制核酸内切酶、pUCm-T载体、离心型质粒提取试剂盒均购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.1.4 培养基 内生菌培养采用LB培养基：酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂粉15 g/L，调节pH到7.2～7.4，高压蒸汽灭菌锅（121℃，20 min）进行灭菌；金黄葡萄球菌培养采用NA培养基：蛋白胨5 g/L、牛肉膏5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂粉17 g/L，后续按照“内生菌培养用LB培养基”方法处理。

1.2 试验方法

1.2.1 黄精内生菌的分离及纯化 采用组织块培养法［8，10］分离黄精内生菌，简述如下。将刚采挖回来优质的黄精块茎表面泥土用洗衣粉洗净，并用流水冲洗黄精块茎表面1 h，将冲洗后的黄精块状茎放入已灭菌的100 mL的三角瓶中，在超净工作台里用75%乙醇浸泡2 min，沥去75%乙醇溶液后用无菌水冲洗5次，再用0.1%HgCl2溶液处理8 min，沥去HgCl2溶液后用无菌水冲洗6次并吸去残留的无菌水，用无菌刀片将黄精块茎切成1 cm3左右的块状，放入LB固体培养基分离内生菌，同时将最后一次冲洗的无菌水作为对照。将培养皿于30℃恒温下培养2～3 d，观察到试验组黄精块茎切口处长出菌落后，用接种环挑取菌体在LB固体培养基上进行纯化，纯化3次后的菌落认定为纯种，将纯种黄精内生菌保存在LB斜面培养基上，置于4℃下冷藏备用。

1.2.2 内生菌发酵及发酵产物抑菌分析

1）内生菌发酵液的制备。取保存的纯种内生菌，挑取少量菌种使用平板划线法接种至新鲜LB培养基上，30℃活化培养12～16 h，挑取活化的单菌落转接至新鲜配制的LB液体培养基，在恒温摇床30℃230 r/min培养12～16 h得到种子液。移取2 mL种子液至100 mL新配制LB液体培养基，于恒温摇床中30℃180 r/min培养7 d。培养结束后，对发酵液以8 000 r/min离心5 min，取离心后的上清液，用旋转蒸发仪浓缩并用无菌水定容至10 mL，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，将过滤所得的发酵液进行抑菌试验。

2）琼脂打孔法对内生菌发酵液进行抑菌分析。参考张昊等［11］关于金黄色葡萄球菌的研究，本试验采用琼脂打孔法［12］进行抑菌活性检测。

1.2.3 黄精内生菌分子生物学鉴定

1）黄精内生菌基因组的提取。基因组的提取，采用熊明华等［13］的SDS基因组DNA提取方法，并稍作改良。

2）16SrDNA的克隆。使用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′对所提取的黄精内生菌基因组DNA进行16SrDNA PCR克隆。PCR体系如表1所示，PCR循环体系如表2所示。PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照，对PCR扩增产物使用柱式DNA胶回收试剂盒回收。

表1 黄精内生菌16Sr DNA PCR反应体系

表2 黄精内生菌16Sr DNA PCR循环体系

3）16SrDNA重组克隆载体的构建及酶切鉴定。回收的PCR产物连接pUCm-T载体，高效大肠杆菌感受态细胞转化，筛选阳性克隆及提取重组质粒，采用酶切体系20μL（重组质粒：5μL，EcoRⅠ0.9μL，PstⅠ0.9μL，ddH2O 13.2μL）鉴定阳性克隆。

4）阳性克隆测序及系统发育分析。将酶切鉴定为阳性克隆的菌株送生工生物工程公司测序，将测得的16SrDNA序列通过NCBI数据库进行BLAST比对，检索其同源序列。选择与目标菌株同源性较高的菌株序列，用软件DNAMAN 9.0进行序列分析，软件MEGA 7.0构建系统发育进化树［14］。

5）内生菌发酵产物多糖含量测定。采用苯酚-浓硫酸法测胞外多糖的含量［15］，并与其寄主黄精多糖含量进行比较。

标准曲线的制备：精密称取于105℃下干燥至恒重的葡萄糖对照品100.0 mg，溶于100.0 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。再吸取5.0 mL溶于25.0 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。分别精密吸取葡萄糖对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于带试管塞的试管中，各加入去离子水补至1.0 mL，加入5%苯酚1.0 mL，摇匀，快速加入浓硫酸5.0 mL，混匀，置于85℃中加热20 min，取出，在常温水中冷却至室温，于490 nm处测定吸光度A，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，建立回归方程。

黄精多糖提取：参考文献［16］，把采集的多年生新鲜黄精块茎清洗干净，切片，于干燥箱中60℃恒温干燥至恒重，研磨成粉，过60目筛。称取10 g溶于pH 5.0的柠檬酸缓冲液中，加入4%纤维素酶，于60 Hz频率、60℃条件下超声提取55 min，过滤，取上清液，真空浓缩至20 mL以下，以4倍无水乙醇沉淀，干燥得固体样品。

内生菌多糖提取：内生菌发酵液以8 000 r/min离心5 min取上清液，以4倍体积无水乙醇于4℃条件下沉淀上清液24 h，8 000 r/min离心5 min取沉淀，并将沉淀于65℃恒温箱中烘干，研磨成粉状备用。

多糖含量测定：把黄精多糖粗提物和内生菌发酵产物多糖粗提物稀释一定倍数于490 nm处测定吸光度A，根据回归方程计算样品中多糖含量。

2 结果与分析

2.1 黄精内生菌的分离及抑菌分析

从黄精块茎中共分离到4株内生细菌，编号分别为H-1、H-2、H-3、H-4。按照“1.2.2”方法制备发酵浓缩液并对金黄色葡萄球菌进行抑菌检测，检测结果见图1。从图1可以看出，H-3抑菌活性最强，其抑菌圈大小约为16.60 mm，抑菌时间长达72 h以上。H-3菌落形态特征为：菌落小、不规则、干燥、白色、透明，经革兰氏染色法鉴定为革兰氏阳性菌。

图1 4株内生菌的发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用

2.2 内生菌H-3的16S rDNA克隆及酶切鉴定

采用改良的SDS法提取黄精内生菌H-3基因组，克隆16SrDNA PCR，用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR克隆产物检测（图2），结果显示克隆到1 500 bp左右的条带。把此条带经DNA纯化回收试剂盒回收，连接pUCm-T载体，并转化大肠杆菌感受态，提取重组质粒，用限制内切酶酶切体系鉴定，结果如图3所示。由图3可以看出，酶切产物与克隆产物基本一致。

图2 H-3菌株16Sr DNA PCR扩增产物电泳结果

图3 H-3菌株16Sr DNA重组质粒酶切产物电泳结果

2.3 黄精内生菌H-3的系统发育分析

将测序后的序列用DNAMAN 9.0进行拼接，将拼接结果提交至NCBI核酸数据库上做BLAST序列比对，发现菌株H-3与菌株Bacillus circulansstrain S1（GenBank号：MK100762.1）和菌株Bacillus circulansstrain 194Fe（GenBank号：KM349200.1）序列的相似度达到98.28%，基本鉴定为芽孢杆菌。利用软件MEGA7.0中的p-distance模型计算进化距离，用邻接法Neighbor-Joining构建系统发育树，随机抽样1 000次，自展法计算进化树的置信度，进化发育树如图4所示。从进化树分析结果可以看出，H-3与菌株Bacilluscirculansstrain S1和菌株Bacilluscirculansstrain 194Fe在系统发育树的同一分支上，结合菌落形态和革兰氏染色等结果，可将该菌鉴定为环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）。

图4 内生菌H-3及其同源菌株的系统进化树

2.4 黄精内生菌H-3发酵产物多糖含量测定

通过对菌株H-3发酵培养，获取发酵产物多糖粗提物，利用苯酚-浓硫酸法测定多糖含量。标准曲线回归方程为Y=0.004X-0.007（R2=0.998 6），表明在0～200μg/mL，吸光度A与葡萄糖浓度有着良好的线性关系。鸡头黄精的多糖含量达31.40%，内生菌H-3发酵液醇提物多糖含量为24.00%。

3 小结与讨论

从陇东地区的野生鸡头黄精中分离到4株内生菌，通过对其进行发酵培养，检测发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌性，筛选出菌株H-3，结合菌落形态、革兰氏染色、系统进化分析，可初步鉴定H-3为环状芽孢杆菌。本研究是首次关于陇东地区黄精内生菌的研究报道，其他地区关于黄精内生菌有相关的研究［7-9］。从黄精内生菌现阶段研究情况看，黄精中普遍存在芽孢杆菌属内生菌，可以筛选到代谢产物具有抑菌活性的菌株。

金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏阳性菌，是一种重要的致病病原体。胡岚等［17］对2015—2019年首都医科大学附属北京友谊医院感染革兰阳性菌菌株分布及耐药性分析中发现，5年临床检测分析了8 406株革兰阳性菌，其中有1 785株是金黄色葡萄球菌。在中国CHINET数据监测网中，统计2019年中国医院内住院的感染患者数据［18］，发现阳性菌主要以金黄色葡萄球菌、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）为主。而在CHINET的数据中显示金黄色葡萄球菌占总分离细菌中的9.34%，进而表明金黄色葡萄球菌是主要的致病菌，因此本研究采用金黄色葡萄球菌作为致病菌进行抑菌分析。在接下来的工作中，陇东地区药用植物研究团队将在抑菌成分结构的解析、内生菌培养条件的优化、抑菌产物的分离纯化等方面继续研究，期望能促进黄精内生菌有价值产物的开发与利用。