柴胡疏肝散精简方对慢性疼痛抑郁共病大鼠中缝核P2X7受体、Caspase-1及IL-1β表达的影响

许丽娥，高雪松，王安娜，杜仪，王永志，赵静洁，2

1.首都医科大学附属北京友谊医院，北京 100050；2.首都医科大学中西医结合学系，北京 100050

研究显示，慢性疼痛患者伴发重度抑郁的发生率约为52%，抑郁症患者伴发疼痛的发生率约为65%。抑郁症是一种以情绪低落和兴趣丧失为特征的慢性精神疾病，具有高患病率、高复发率及自杀倾向。临床上抑郁症患者除情绪症状外，还会出现不同程度和表现的躯体疼痛。疼痛和抑郁常共同发病，并有累加效应。因此，疼痛与抑郁共病受到越来越多的关注。疼痛抑郁共病属中医学“郁证”范畴，其病机为肝气郁滞，气机不畅，不通则痛，治疗以疏肝解郁、行气止痛为主，临床多用柴胡疏肝散加减治疗。

抑郁症发病机制至今尚未阐明，炎症假说近年备受关注。有学者认为，抑郁症是神经免疫炎症疾病，炎症介质诱导神经源性炎症反应，进而使外周感觉神经敏感性增强，传递痛刺激的感受器过度敏化，导致痛觉过敏。P2X7受体在中枢神经系统神经元及星型胶质细胞中高表达，其激活后可活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1，进而促进白细胞介素（IL）-1β等促炎因子释放，在炎症反应及疼痛中发挥重要作用。既往研究表明，柴胡疏肝散有较好的抗炎效果，但其能否通过下调P2X7 受体进而调节Caspase-1/IL-1β信号通路发挥作用尚不清楚。本研究采用利血平致慢性疼痛抑郁共病大鼠模型，观察柴胡疏肝散精简方对P2X7受体及Caspase-1/IL-1β信号通路的调节作用，揭示其抗抑郁止痛的部分机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康雄性SD大鼠40只，体质量180～220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2014-0004，饲养于北京友谊医院实验动物中心，动物使用许可证号SYXK（京）2012-0023，温度（21±1）℃，湿度30%～40%，12 h昼夜节律，自由摄食饮水。

1.2 药物

柴胡疏肝散精简方（柴胡9 g，白芍15 g，枳壳9 g，香附9 g），免煎颗粒由北京康仁堂药业有限公司提供，用蒸馏水将免煎颗粒溶解，配制成浓度为1.6 g/mL混悬液。盐酸氟西汀分散片，苏州礼来制药有限公司，批号4145A，用蒸馏水配制成0.4 mg/mL溶液。利血平注射液，天津金耀药业有限公司，批号2020905，用蒸馏水配制成0.1 g/L溶液。

1.3 主要试剂与仪器

超纯RNA提取试剂、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture（With ROX）、DNase1、5×RNA Loading Buffer（北京康为世纪生物科技有限公司，货号分别为CW0581、CW0744、CW0956、CW2090、CW0611A），总蛋白提取试剂盒（上海贝博生物科技有限公司，货号BB-3101），BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号PC0020），IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抗体及IL-6、TNF-α ELISA试剂盒（英国Abcam公司，货号分别为ab233706、ab183218、ab234570、ab236712），β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（美国Immunoway公司，货号分别为B1501、B0201）。分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司，型号NANODROP 2000），荧光定量PCR仪（杭州博日科技股份有限公司，型号Line Gene 9600 Plus），冰冻切片机（德国Leica公司，型号CM1950），超速低温离心机（德国Sigma公司，型号Sigma-2K15），高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号SCIENTZ-48），电泳仪（北京市六一仪器厂，型号DYY-7C），涡旋震荡仪（上海其林贝尔仪器制造有限公司，型号VORTEX-6），转膜仪（美国Bio-Rad 公司，型号170-3940），智能热板仪（北京众实迪创科技发展有限责任公司，型号YLS-6B）。

1.4 分组、造模及给药

采用随机数字表法将40只大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀组和柴胡疏肝散精简方组（精简方组），每组10只，实验前适应性喂养1周。除空白组外，其余各组按0.3 mg/kg腹腔注射利血平制备慢性疼痛抑郁共病大鼠模型，空白组腹腔注射等量蒸馏水，每日1次，连续14 d。造模同时，按照成人与大鼠体表面积换算给药剂量，氟西汀组按2 mg/kg灌胃氟西汀溶液，精简方组按8 g/kg灌胃柴胡疏肝散精简方混悬液，灌胃体积5 mL/kg，空白组及模型组灌胃等量蒸馏水。

1.5 大鼠体质量检测

分别测量大鼠给药前后（实验第1日及第14日）体质量，计算体质量增量。

1.6 强迫游泳实验

给药结束后，将大鼠逐只放入高60 cm、直径30 cm透明玻璃桶内（水深40 cm、水温23～27 ℃），用摄像机记录大鼠10 min的游泳录像，由2位实验人员采用盲法观看游泳录像5 min（第3～8 min），计录大鼠强迫游泳不动时间，以四肢不动、漂浮于水面、仅头部露出水面呼吸为大鼠不动状态。

1.7 旷场实验

给药结束后，将大鼠置于100 cm×100 cm×40 cm的四面涂黑旷场中，利用软件将旷场分为4×4方格，摄像头记录大鼠行动轨迹，测定3 min内大鼠运动总距离及穿格次数。

1.8 热缩足阈值测定

给药结束后，应用智能热板仪检测大鼠热痛敏感阈值，热板仪温度设定为（55±1）℃，将大鼠右后足底置于热板仪上，以大鼠明显缩足回避为阳性反应，记录大鼠缩足时间，同法测定大鼠左后足缩足时间，以左右两侧平均值作为该大鼠热缩足阈值。

1.9 取材

1%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠，快速断头，于冰上颈动、静脉混合取血，4 ℃静置4 h，3 000 r/min离心15 min，吸取血清，置于-80 ℃冰箱保存备用。冰上分离大脑，参照大鼠脑立体定位图谱定位中缝核并取出，放入干冰中预冷后，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.10 ELISA检测

采用ELISA 试剂盒检测血清IL-6、TNF-α 含量，严格按试剂盒说明书操作。

1.11 RT-PCR检测

超纯RNA提取试剂盒提取中缝核总RNA，进行RNA 电泳，用cDNA 合成试剂盒进行反转录，进行PCR扩增，扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、50 s，共40个循环。以GAPDH为内参，2法计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.12 Western blot检测

中缝核组织剪碎后置于1.5 mL EP管中，预冷PBS漂洗2次；加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），匀浆机匀浆后冰上裂解30 min；离心后取上清液，BCA法检测蛋白浓度；样品经上样、电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭、TBST洗膜后，分别滴加IL-6一抗（1∶1 000）、TNF-α一抗（1∶1 000）、β-actin一抗（1∶3 000），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜4次，每次8 min；滴加相应二抗（1∶5 000），37 ℃摇床孵育2 h，TBST洗膜；ECL曝光后显影，采用Image J 1.8.0软件进行分析，以β-actin 为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.13 统计学方法

2 结果

2.1 柴胡疏肝散精简方对模型大鼠体质量增量的影响

与空白组比较，模型组大鼠体质量增量明显减少（＜0.05）；与模型组比较，氟西汀组和精简方组大鼠体质量增量明显增加（＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠体质量增量比较（，每组10只）

2.2 柴胡疏肝散精简方对模型大鼠强迫游泳不动时间的影响

与空白组比较，模型组大鼠强迫游泳不动时间明显增加（＜0.05）；与模型组比较，氟西汀组和精简方组大鼠强迫游泳不动时间明显减少（＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠强迫游泳不动时间比较（，每组10只）

2.3 柴胡疏肝散精简方对模型大鼠运动总距离及穿格次数的影响

与空白组比较，模型组大鼠旷场实验运动总距离及穿格次数明显减少（＜0.05）；与模型组比较，氟西汀组和精简方组大鼠运动总距离及穿格次数明显增加（＜0.05）。见图3。

图3 各组大鼠旷场实验运动总距离和穿格次数比较（，每组10只）

2.4 柴胡疏肝散精简方对模大鼠热缩足阈值的影响

与空白组比较，模型组大鼠热缩足阈值明显降低（＜0.05）；与模型组比较，氟西汀组和精简方组大鼠热缩足阈值明显升高（＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠热痛缩足阈值比较（，s）

2.5 柴胡疏肝散精简方对模大鼠血清白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α含量明显增加（＜0.05）；与模型组比较，氟西汀组和精简方组大鼠血清IL-6、TNF-α 含量明显减少（＜0.05）。见图4。

图4 各组大鼠血清IL-6、TNF-α含量比较（，每组10只）

2.6 柴胡疏肝散精简方对模大鼠中缝核P2X7 受体、Caspase-1及白细胞介素-1β mRNA表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠中缝核P2X7 受体、Caspase-1 及IL-1β mRNA 表达明显升高（＜0.05）；与模型组比较，氟西汀组和精简方组大鼠中缝核P2X7受体、Caspase-1及IL-1β mRNA表达明显降低（＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠中缝核P2X7受体、Caspase-1及IL-1β mRNA表达比较（）

2.7 柴胡疏肝散精简方对模型大鼠中缝核白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠中缝核IL-6、TNF-α蛋白表达明显升高（＜0.05）；与模型组比较，氟西汀组和精简方组大鼠中缝核IL-6、TNF-α蛋白表达明显降低（＜0.05）。见图5。

图5 各组大鼠中缝核IL-6、TNF-α蛋白表达比较（，每组10只）

3 讨论

目前关于抑郁症的发病机制尚不清楚，主要有单胺类神经递质假说、神经受体假说、神经营养和可塑性假说、神经内分泌假说、神经免疫炎症假说等。免疫炎症假说越来越受到关注。研究发现，抑郁症通常伴有炎症、自身免疫反应、氧化和亚硝化应激反应及神经退行性病变等，而这些反应部分是由IL-1水平升高引起。炎症因子可激活吲哚胺2,3 双加氧酶（IDO），IDO的激活又使合成5-羟色胺（5-HT）的原料色氨酸通过犬尿氨酸代谢通路消耗，从而降低5-HT的合成，进而出现抑郁样表现。P2X7受体是嘌呤受体的一个亚型，为ATP控制的离子通道，其在中枢神经系统表达丰富，被ATP激活后导致K外流和Ca内流，及非选择性膜孔形成，启动一系列信号途径如炎症小体NLRP3活化、Caspase-1和核因子-κB激活等，增强炎性细胞因子转录，介导IL-1β、IL-6、TNF-α等多种炎性因子释放，参与炎症发生发展。同时P2X7受体还参与疼痛的调节。

中医认为，疼痛抑郁共病基本病机为肝郁气滞，不通则痛，临床以疏肝类中药复方治疗，效果显著。柴胡疏肝散出自《景岳全书》，用于“治胁肋疼痛，寒热往来”，为经典疏肝理气剂，具有疏肝解郁、行气止痛功效。原方为“醋炒陈皮、柴胡各二钱，川芎、麸炒枳壳、芍药各一钱半，炙甘草五分，香附一钱半”，“水一盅半，煎八分，食前服”。柴胡疏肝散具有较好的抗炎作用，不仅可降低外周血炎症因子IL-6、TNF-α含量，还可减少中缝核IL-6、TNF-α蛋白表达，通过抑制炎症因子的释放抑制IDO 激活，从而促进5-HT合成，但其发挥抗炎作用的上游分子机制尚不清楚。P2X7受体作为启动炎症级联反应的关键蛋白，柴胡疏肝散是否通过影响该靶点发挥抗炎作用，目前缺少明确研究。本研究使用柴胡疏肝散精简方是根据原方进行化裁，由柴胡9 g、白芍15 g、枳壳9 g、香附9 g组成，增加君药柴胡剂量以增强疏肝解郁之功，增加枳壳、香附剂量而重理气，重用白芍以养血柔肝，同时去掉辛燥之川芎、理气之陈皮。本研究结果显示，精简方组大鼠中缝核P2X7 受体、Caspase-1、IL-1β mRNA及IL-6、TNF-α蛋白表达明显降低，提示柴胡疏肝散精简方可能通过抑制P2X7受体及Caspase-1/IL-1β表达，抑制中缝核炎症因子释放，从而发挥抗疼痛抑郁功效。

综上所述，柴胡疏肝散精简方可通过降低慢性疼痛抑郁共病大鼠中缝核P2X7受体mRNA表达，进而抑制Caspase-1/IL-1β 通路，降低中缝核及血清IL-6、TNF-α水平，减轻炎症反应，提高大鼠痛阈值及改善抑郁行为。