壮腰通络方对腰椎间盘退行性病变大鼠病理变化及血清炎症因子表达的影响

孙凯，魏戌，朱立国，2，张平，银河，尹逊路，朱宏伟，秦晓宽

1.中国中医科学院望京医院，北京 100102；2.中医正骨技术北京市重点实验室，北京 100007

腰背痛是骨伤科临床最常见的慢性疼痛疾病，具有患病率高、疾病负担重、容易复发等特点，严重影响患者工作效率和生活质量。腰椎间盘退行性病变（lumbar intervertebral disc degeneration，LIDD）是引起腰背痛的主要原因。研究表明，在50岁以上人群中，超过80%会出现椎间盘退变相关病理变化。中药治疗LIDD疗效显著。前期临床观察显示，壮腰通络方可有效改善腰椎间盘突出症患者腰膝酸软等不适症状，但其作用机制尚未阐明。腰痹通胶囊作为上市中成药广泛用于腰腿疼痛的临床治疗，研究表明，其能提高兔椎间盘Ⅱ型胶原含量，下调肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-1β mRNA表达，有效延缓LIDD。因此，本研究以腰痹通胶囊为对照，观察壮腰通络方对模型大鼠椎间盘病理变化及血清炎症因子表达的影响，为明确其延缓LIDD的作用机制奠定实验基础。

1 实验材料

1.1 动物

健康雄性SD大鼠65只，5月龄，体质量（400±20）g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2019-0010，动物质量合格证号110324210101287583。饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所动物房，温度（25±3）℃，相对湿度（55±10）%，12 h光暗交替，自由摄食饮水，每周更换2次垫料。实验操作遵守实验动物福利伦理原则。

1.2 药物及制备

壮腰通络方（杜仲15 g、熟地黄15 g、当归12 g、丹参12 g等9味药组成），饮片购于中国中医科学院望京医院药学部，由中日友好医院制剂室制备，饮片经煎煮、过滤后，浓缩至原药材浓度分别为1.425、0.713、0.356 g/mL，置于-4 ℃冰箱备用。腰痹通胶囊，江苏康缘药业股份有限公司，0.42 g/粒，批号18081309885，取内容物，配制成0.025 g/mL药液。

1.3 主要试剂与仪器

Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号G1340），大鼠IL-6 ELISA 试剂盒、大鼠TNF-α ELISA试剂盒、基质金属蛋白酶（MMP）13抗体、聚集蛋白聚糖（Aggrecan）抗体、复合消化液、抗原修复液（武汉博士德生物工程有限公司，货号分别为EK0412、EK0526、A00420-2、BA2967-1、AR0022、AR0026）。ASP300 脱水机（德国徕卡公司），EG1150H 包埋机（德国徕卡公司），RM2235 切片机（德国徕卡公司），90型号牙科打磨机（功成医疗器械专营店），SynergyH1 酶标仪（美国伯腾仪器有限公司），TDZ4A-WS台式低速离心机（湖南湘仪仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

大鼠适应性喂养1周后，随机抽取10只作为空白组，其余55只为造模组。造模前12 h禁食，0.3%戊巴比妥钠（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，剔除腰背部毛发，俯卧位固定于实验台，碘酊和75%酒精消毒，以大鼠双侧髂嵴为体表骨性定位标志，以腰背部正中线与两侧髂后上棘连线交点为手术切口，沿切口上下各延伸1.5 cm左右，钝性分离，充分暴露L～L棘突及两侧关节突关节，使用拉钩撑开两侧皮肤和椎旁肌肉，咬骨钳小心咬除L～L棘突（避免破坏椎板），牙科打磨机磨除两侧关节突关节，逐层缝合伤口，将伤口表面血渍擦除干净。因麻醉及手术不当死亡4只，剩余51只大鼠随机分为模型组、腰痹通胶囊组及壮腰通络方高、中、低剂量组。根据人与大鼠体表面积换算给药剂量，壮腰通络方高、中、低剂量组分别按22.5、11.25、5.625 g/kg灌胃（相当于60 kg成人临床用药量的2、1、0.5 倍），腰痹通胶囊组按0.394 g/kg灌胃，灌胃体积10 mL/kg，空白组和模型组灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续8周。

2.2 取材

给药结束后，0.3%戊巴比妥钠（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，室温静置2 h，3 000 r/min离心15 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存，用于血清炎症因子及生化指标检测。取造模腰椎节段，剔除其他组织后，将椎体及椎间盘置于4%多聚甲醛中固定，用于Masson染色及免疫组化检测。

2.3 检测指标

2.3.1 Masson染色

将大鼠椎间盘组织置于4%多聚甲醛中固定1周后进行脱钙处理，每周更换2次脱钙液，脱钙3周，病理组织脱水机脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，切片脱蜡至水，苏木素染色5 min，自来水冲洗5 min，盐酸酒精分化5～10 s，蒸馏水浸洗3 min，丽春红酸性复红染色液染色5 min，2%冰醋酸浸洗1 min，1%磷钼酸分化5～10 s，苯胺蓝染色5 min，0.2%冰醋酸浸洗1 min，脱水、透明后，中性树胶封片，显微镜下观察。

2.3.2 血清炎症因子及生化指标检测

取大鼠血清，参照ELISA 试剂盒说明书检测TNF-α和IL-6含量，全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血尿素氮（BUN）和血肌酐（SCr）水平。

2.3.3 免疫组化检测

椎间盘组织石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗3 次，PBS 洗2 次，柠檬酸缓冲液高压锅抗原修复3 min，PBS 洗2 次，每次5 min，3%HO室温静置10 min，PBS 洗2 次，每次5 min，分别滴加Aggrecan（1∶100）、MMP13（1∶50）一抗，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加二抗，37 ℃孵育50 min，PBS洗3 次，每次5 min，DAB 显色3～5 min，自来水冲洗，苏木素复染2 min，盐酸酒精分化，脱水、透明后，中性树胶封片，置于显微镜下观察，以棕色染色为阳性表达，计算阳性表达的平均光密度。

3 统计学方法

4 结果

各组大鼠一般情况良好，正常进食，初期因造模后伤口未完全愈合，部分大鼠出现皮下血肿，灌胃时出现躁动不配合甚至伤口裂开情况。因灌胃损伤等原因，空白组、腰痹通胶囊组各死亡1只，模型组、壮腰通络方高、中剂量组各死亡2只。最终空白组9只、模型组9只、壮腰通络方高剂量组8只、壮腰通络方中剂量组8 只、壮腰通络方低剂量组10 只、腰痹通胶囊组9只。

4.1 壮腰通络方对模型大鼠椎间盘组织病理形态的影响

空白组大鼠椎间盘形态结构较完整，髓核细胞核呈深蓝色，可见丰富的胶原间质，排列有序，椎间盘退变程度最轻；模型组大鼠椎间盘髓核细胞明显减少，零星分布，排列不规则，椎间盘退变程度最重；壮腰通络方高剂量组大鼠椎间盘髓核细胞明显减少，分布不均匀，椎间盘退变程度较重；壮腰通络方中剂量组大鼠椎间盘髓核细胞分布较规则，可见明显胶原纤维，椎间盘退变程度较轻；壮腰通络方低剂量组大鼠椎间盘髓核细胞相对减少，可见胶原纤维散在分布，椎间盘退变程度相对较轻；腰痹通胶囊组大鼠椎间盘髓核细胞较多，排列较规则，可见胶原纤维分布，椎间盘退变程度较轻。见图1。

图1 各组大鼠椎间盘组织形态（Masson染色，×400）

4.2 壮腰通络方对模型大鼠血清炎症因子和生化指标的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清TNF-α和IL-6含量增加（＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠血清TNF-α含量减少（＜0.05），壮腰通络方中剂量组和腰痹通胶囊组大鼠血清IL-6含量减少（＜0.05）。见图2。各组大鼠血清ALT、AST、BUN和SCr差异无统计学意义（＞0.05），见图3。

图2 各组大鼠血清TNF-α和IL-6含量比较（，每组8～10只）

图3 各组大鼠血清生化指标比较（，每组8～10只）

4.3 壮腰通络方对模型大鼠椎间盘组织聚集蛋白聚糖和基质金属蛋白酶13表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠椎间盘组织Aggrecan表达明显降低，MMP13表达明显升高，差异均有统计学意义（＜0.05）；与模型组比较，壮腰通络方中、低剂量组和腰痹通胶囊组大鼠椎间盘组织Aggrecan表达明显升高，MMP13表达明显降低，差异有统计学意义（＜0.05）。见图4～图6。

图4 各组大鼠椎间盘组织Aggrecan阳性表达（免疫组化染色，×400）

图5 各组大鼠椎间盘组织MMP13阳性表达（免疫组化染色，×400）

图6 各组大鼠椎间盘组织Aggrecan和MMP13表达比较（，每组8～10只）

5 讨论

随着人口老龄化发展及生活方式的改变，以LIDD为代表的脊柱退行性疾病患病人数不断增加。中医药在治疗该类疾病中发挥了重要作用。LIDD属中医学“腰痛”“腰腿痛”“腰痹”等范畴，肝主筋，肾主骨，其发生发展与肝、肾等脏腑功能及阴阳平衡密切相关。《杂病源流犀烛》记载：“腰痛，精气虚而邪客病也……肾虚，其本也；风寒湿热、痰饮、气滞血瘀、闪挫，其标也。”本病多见于中老年患者，以肝肾亏虚为本，临床常兼夹其他证候，如肾虚感受外邪、风寒湿邪兼夹气滞血瘀等。夏炳江等认为，LIDD病机以五脏虚损为本，痰浊瘀血为标。本研究中壮腰通络方在补益肝肾、活血通络治法指导下，以杜仲、熟地黄等入肝、肾经药物为主。杜仲甘温，偏于补阳，常用于肝肾不足之腰膝酸痛、痿软无力之证；熟地黄微温，偏于补阴，具有补血滋阴、益精填髓功效。二者阴阳并补，共奏补肝肾、强筋骨、益精髓功效。肾充则骨强，肝充则筋健，当归、丹参皆可入肝经以补血养血、活血祛瘀止痛。该方治疗腰椎退行性疾病取得了较好的临床效果。

LIDD过程复杂，髓核、纤维环、软骨终板等重要组成部分的变化均会影响椎间盘退变。其病变与衰老、遗传、局部异常应力集中、炎症因子刺激等因素密切相关。在退变过程中，椎间盘细胞外基质（ECM）合成减少，降解酶类增加，椎间盘内Ⅱ型胶原及蛋白聚糖含量显著降低，Ⅰ型胶原含量显著增加。Aggrecan是椎间盘蛋白聚糖中最重要的组成部分，通过其硫酸软骨素和硫酸角质素链维持椎间盘组织的水合作用，其含量下降是椎间盘早期退变的标志性事件。本研究结果显示，模型组大鼠椎间盘组织Aggrecan表达降低，导致椎间盘渗透压逐渐下降，进而形成恶性循环，加速椎间盘退变。壮腰通络方和腰痹通胶囊干预后，能延缓Aggrecan丢失。MMP13是MMPs家族的重要胶原酶，不仅能降解Ⅱ型胶原，还能降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅹ型胶原，在椎间盘及软骨胶原破坏中扮演重要角色。本研究显示，模型组大鼠椎间盘组织MMP13表达升高，壮腰通络方和腰痹通胶囊能降低模型大鼠椎间盘组织MMP13表达。

在LIDD发展中，IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等炎症因子刺激导致MMPs和Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶表达上调，加剧ECM降解，下调ECM合成相关基因表达。Schistad等研究表明，血清IL-6水平升高不利于腰椎疼痛患者恢复。本研究发现，壮腰通络方能降低大鼠血清TNF-α和IL-6含量，表明其能抑制炎症因子表达，发挥治疗LIDD作用。同时，血清生化指标检测结果显示，各组之间差异无统计学意义，表明壮腰通络方给药后不会造成大鼠肝、肾功能损伤。

综上所述，壮腰通络方可有效延缓大鼠LIDD，且具有较好的安全性，其作用机制可能与延缓Aggrecan丢失、降低MMP13及血清炎症因子水平有关。本研究初步揭示壮腰通络方治疗LIDD的作用机制，为今后深入研究奠定基础。