线粒体DNA T16189C变异与妊娠糖尿病的关系

张小勤，周玉兰，付竹梅，韩学学，展 洁

（1.潍坊市妇幼保健院检验科，山东 潍坊 261011；2.潍坊市妇幼保健院超声科，山东 潍坊 261011；3.潍坊市妇幼保健院产科，山东 潍坊 261011）

妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）可大大增加孕妇和胎儿发生并发症及合并症的风险[1-2]。部分在怀孕之前无胰岛素抵抗表现的孕妇随着孕期糖稳态的不断受压，会发展成GDM[3]。GDM与2型糖尿病有共同的病理生理基础，且GDM患者未来发展为2型糖尿病的风险更高[4-5]。在对胰岛素抵抗、肥胖和2型糖尿病的研究过程中，mtDNA T16189C变异引起了学者们的关注。该变异位点接近线粒体复制起始点，在维持细胞拷贝数和线粒体转录中起重要作用[6]。此外，线粒体单链DNA结合蛋白与mtDNA 16189C的结合力低于其与mtDNA 16189T的结合力。有研究结果显示，在亚洲人群中，mtDNA T16189C变异的发生率与2型糖尿病患者空腹胰岛素水平升高、胰岛素抵抗和β细胞功能受损有关[7]。但这种变异是否能影响GDM的发病尚不清楚。为此，本研究拟探讨mtDNA T16189C变异与GDM发生风险的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2019年1—10月潍坊市妇幼保健院定期产检的GDM孕妇204例（GDM组），年龄（32.09±3.51）岁；正常孕妇220例（对照组），年龄（31.54±4.57）岁。所有孕妇均为单胎妊娠，孕期为24～28周。GDM诊断标准：（1）空腹血糖≥5.1 mmol/L；（2）口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）1 h血糖≥10.0 mmol/L；（3）OGTT 2 h血糖≥8.5 mmol/L。排除标准：（1）多胎妊娠；（2）孕前有糖尿病史和其他内分泌疾病史；（3）肝、肾功能不全；（4）有高血压史；（5）近期服用过影响糖代谢的药物；（6）有其他家族遗传史。本研究经潍坊市妇幼保健院医学伦理学委员会批准，所有对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料 对所有对象进行体格检查，并询问病史，收集临床资料，包括年龄、孕周、体质量指数（body mass index，BMI）及空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、糖化血红蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）、空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）检测结果。计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）：HOMAIR=FINS×FBG/22.5。

1.2.2 mtDNA 16189变异位点检测 采用乙二胺四乙酸抗凝管采集所有对象禁食8～12 h后的空腹静脉血2 mL，充分混匀后采用血液基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取全基因组DNA，-20 ℃保存。采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）对mtDNA D-loop区进行扩增，试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，检测仪器为PTC-200 PCR仪（美国伯乐公司）。扩增引物序列见表1。反应体系：总体积为30 μL，10×Ex Taq buffer 3 μL、dNTP 2 μL、PrimerF 1 μL，PrimerR 1 μL，Ex Taq 0.2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 20.8 μL。反应条件：96 ℃预热5 min；96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循环30次；72 ℃延长5 min，4 ℃保存。按96孔纯化板（德国Millipore公司）说明书进行PCR产物纯化。为了避免线粒体D-Loop区单测序结果受影响，保证测序的准确性，本研究使用2对测序引物进行双重测序，测序引物序列见表1。由深圳华大基因测序公司完成测序。使用Chromas软件（北京天演融智软件有限公司）对基因序列进行分析，并与人mtDNA文库记录的剑桥参考序列（Cambridge reference sequence，CRS）进行比对，分析查找mtDNA 16189变异位点序列。

表1 扩增引物和测序引物序列

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析。呈正态分布的数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验。基因频率分布比较采用χ2检验。基因变异对GDM的影响采用比值比（odds ratio，OR）和95%可信区间（confidence interval，CI）表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GDM组与对照组一般资料比较

GDM组FBG、OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、HbA1c和FINS均高于对照组（P<0.05），年龄、孕周和BMI 2个组之间差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 GDM组与对照组一般资料比较

2.2 mtDNA T16189C变异与GDM的关系

GDM组有72例（35.29%）携带mtDNA T16189C变异位点，对照组有57例（25.91%）携带该变异位点。GDM组mtDNA T16189C变异频率高于对照组（χ2=4.40，P<0.05）。测序结果见图1。

图1 mtDNA16189位点测序结果

携带mtDNA T16189C变异位点是GDM发生的危险因素（OR=1.36，95%CI为1.020～1.823）。

2.3 mtDNA T16189C变异与妊娠期胰岛素抵抗的关系

根据是否携带mtDNA T16189C变异将GDM孕妇分为携带组和非携带组。携带组OGTT 1 h血糖、OGTT 2 h血糖、FINS、HOMA-IR水平高于非携带组（P<0.05），FBG、HbA1c2个组之间差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 mtDNA T16189C变异携带组与非携带组各项指标比较

3 讨论

虽然多数GDM孕妇产后糖代谢可恢复正常，但其未来患2型糖尿病的风险是正常孕妇的7倍[4]。目前，多数学者认为胰岛素抵抗是GDM的病理生理基础，贯穿着GDM发生、发展的全过程[7]。由于线粒体在能量产生和自由基生成中起关键作用，所以线粒体基因组可能对多种能量代谢相关疾病的产生和发展有重要影响[8]。1998年，POULTON等[9]提出mtDNA T16189C变异与胰岛素抵抗有关。随后的研究结果显示，mtDNA T16189C位点变异与胰岛素抵抗、BMI、代谢综合征和心血管疾病有关[10]。因此，为进一步了解mtDNA T16189C变异是否与GDM有关，本研究对GDM孕妇的mtDNA T16189C变异情况进行了分析，结果显示，GDM组mtDNA T16189C变异频率高于对照组（P<0.05），携带mtDNA T16189C变异是GDM发生的危险因素（OR=1.36，95%CI为1.020～1.823）。

妊娠期出现胰岛素抵抗是属于妊娠期的生理代谢变化。本研究结果显示，GDM组FINS显著高于对照组（P<0.05），提示GDM孕妇与正常孕妇相比存在更严重的胰岛素抵抗。另外，mtDNA T16189C变异携带组FINS、HOMAIR水平均高于非携带组（P<0.05），说明携带mtDNA T16189C变异的GDM孕妇的胰岛素抵抗情况更严重。但关于mtDNAT16189C变异在GDM发生中的具体作用尚需要进一步研究。

综上所述，GDM孕妇mtDNA T16189C变异频率显著升高，该位点变异是GDM发生的危险因素，携带mtDNA T16189C变异的GDM孕妇的胰岛素抵抗更严重。虽然mtDNA T16189C变异的致病机制尚不明确，但其作为GDM发生的风险基因，携带该变异位点的孕妇需加强妊娠期管理，严格控制血糖和体质量，预防GDM的发生。