两种不同培养基制备方法对振荡法抗菌性测试结果的影响

朱晓辉，邓智成，张诗琪，王 强，余圆圆，周 曼

（江南大学纺织科学与工程学院生态纺织教育部重点实验室，江苏无锡 214122）

随着科技的进步，人们生活水平不断提高，对于服装的功能性要求越来越高［1］。尤其是近两年来全球新型冠状病毒肆虐，在经历了口罩、防护服等纺织品的短缺后，人们对抗菌抗病毒纺织品有了更大的需求。因此，抗菌纺织品的检测方法与标准也相应地得到了重视。目前，常用的定量抗菌测试方法有吸收法和振荡法［2］；其中，振荡法因为对试样的形状和吸水性要求不高［3］，所以得到了更为普遍的应用。

目前，我国制定的纺织品振荡法抗菌测试方法及标准有：GB/T 20944.3—2008《纺织品 抗菌性能的评价 第3 部分：振荡法》、FZ/T 73023—2006《抗菌针织品》附录D.8。两种标准所描述的测试方法基本相同。在最后的制板方法中，两种标准均采用倒板法，即振荡接触结束后，在稀释至合适倍数的菌液中浇筑液态琼脂，混合均匀制板。然而在实际的文献阅读中，我们发现更多的研究人员在制板时使用划板法［4-5］，即将菌液均匀地涂布在凝固的琼脂平板上。因此，本研究采用振荡法测试不同织物、不同菌种以及具有不同抑菌率试样的抗菌性，并比较了两种不同琼脂培养基制备方法对抑菌率结果的影响。

1 实验

1.1 试剂与菌种

胰蛋白胨、牛肉浸膏、琼脂粉（生化试剂），十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氢氧化钠（分析纯），均购自国药集团化学试剂有限公司；抗菌整理剂M（市售），大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 6538（南京乐诊生物技术有限公司）。

1.2 仪器

SW-CJ-2D 型双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司），TS-2102C 立式恒温振荡培养箱（上海天呈实验仪器制造有限公司），LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），SHJ-A4 恒温磁力搅拌水浴锅（常州高德仪器制造有限公司），R-3型自动定形烘干机（厦门瑞比精密机械有限公司），ME403 电子天平（梅特勒-托利多国际有限公司），一次性培养皿以及实验室常用玻璃仪器。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基和缓冲溶液的配制

营养肉汤：牛肉浸膏3 g，胰蛋白胨5 g，去离子水1 000 mL，用0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液调节pH 至6.8±0.2，灭菌后保存备用。

营养琼脂培养基：胰蛋白胨5 g，琼脂粉15 g，去离子水1 000 mL，加热煮沸，用0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液调节pH至6.8±0.2，灭菌后保存备用。

磷酸盐（PBS）缓冲溶液：十二水合磷酸氢二钠7.736 g，二水合磷酸二氢钠1.31 g，去离子水1 000 mL，pH为7.2±0.2，灭菌后保存备用。

1.3.2 抗菌试样的准备

本实验采用浸渍整理法制备抗菌试样。分别称取抗菌整理剂M 10.5、1.5 g，加入去离子水配成1 000 mL 的整理液；将棉、涤纶织物放入整理液，在40 ℃的恒温水浴锅中浸渍1 h；脱去部分整理液使带液率约为80%，60 ℃烘干，再于160 ℃焙烘2 min，即得到不同质量浓度抗菌整理剂M 整理的棉、涤纶织物。以标准棉布为对照样，分别称取对照样与抗菌织物（0.75±0.05）g，剪成5 mm×5 mm 的碎片，用锡纸包好，灭菌备用。

1.3.3 细菌接种菌悬液的制备

采用平板划线法，将3～10 代细菌接种在营养琼脂平板上，在37 ℃下培养18～24 h。培养完成后，用接种环取一个典型菌落，接种在20 mL 营养肉汤中，放置于振荡培养箱中，37 ℃、130 r/min 培养18～24 h，即得到细菌接种菌悬液。

1.3.4 细菌接种菌液的准备

取3 个离心管，在其中2 个中加入9 mL 营养肉汤，另外1 个中加入9 mL PBS 缓冲溶液。从细菌接种菌悬液中吸取2 mL 添加到第1 个9 mL 营养肉汤中，充分混匀后取1 mL 添加到第2 个9 mL 营养肉汤中，充分混匀后再取1 mL 添加到9 mL PBS 缓冲溶液中。从上述溶液中吸取5 mL，移入装有45 mL PBS 缓冲溶液的锥形瓶中，得到细菌接种菌液。

1.3.5 “0”接触时间制样及抗菌试样振荡接触［6］

将灭菌后的抗菌试样和对照样分别放入锥形瓶中，加入70 mL PBS 缓冲溶液。从细菌接种菌液中每次吸取5 mL，分别加入每个锥形瓶中。对照样立即用力振荡1 min，从对照样中吸取1 mL，用10 倍稀释法稀释2次，混匀后，吸取1 mL移入培养皿中，倾注营养琼脂培养基约15 mL制板，制作2个平行样。室温凝固后，倒置于恒温培养箱中，于37 ℃下培养24 h。将其他装有抗菌试样和对照样的锥形瓶放置在恒温振荡培养箱中，在24 ℃、150 r/min振荡接触18～24 h。

1.3.6 两种不同的制板方法

倒板法：将振荡接触后的抗菌试样以10 倍稀释法稀释至合适的倍数，从所需倍数的离心管中吸取1 mL，移入培养皿中，倾注灭菌后液态的营养琼脂培养基约15 mL，每个倍数制作2个平行样。室温凝固后倒置于恒温培养箱中，37 ℃培养24～48 h。

划板法：在抗菌试样振荡接触的过程中，提前将灭菌后的液态琼脂培养基倒入培养皿中，每个培养皿倒入15～20 mL，室温静置凝固，适当用小风吹，使凝固后的琼脂平板干湿度适中；待振荡接触结束后，用10 倍稀释法将各个抗菌试样稀释至合适的倍数，从所需倍数的离心管中吸取1 mL，移至琼脂板上，用涂布棒均匀地涂布在平板上，每个倍数制作2 个平行样，放置于恒温培养箱中，37 ℃培养24～48 h。

1.4 测试

1.4.1 实验有效性判定

根据式（1）计算实验菌种的细菌增长值F。当F大于等于1.5 时，实验判定为有效；否则实验数据无效，需重新进行［7］。

式中，Wt为经过振荡接触后对照样制板所得菌落数的平均值；W0为对照样“0”接触时间制样所得菌落数的平均值。

1.4.2 抑菌率的计算

根据式（2）计算抗菌试样的抑菌率Y。

式中，Wt为经过振荡接触后对照样制板所得菌落数的平均值；X为经过振荡接触后抗菌试样制板所得菌落数的平均值。

2 结果与讨论

2.1 菌落外观

以1.5 g/L 抗菌整理剂M 整理织物对大肠杆菌的抗菌结果为例，两种不同培养基制备方法所得到的细菌菌落生长情况如图1 所示。由图1 可以明显看出两种不同制板方法结果的差异，通过倒板法所制备的琼脂平板经过24～48 h 的培养后，其表面生长的菌落数量较多，但是形状较小，形态呈现为点状；而通过划板法所制备的琼脂平板则得到相反的情况，其表面生长的菌落数量较少，但是形状较大，形态呈现为圆形。结果表明，使用倒板法制板的菌液较为分散，菌落生长得比较均匀；而使用划板法制板的菌液在涂布时不如倒板法均匀，生长的菌落容易聚集。

图1 抗菌整理剂整理织物对大肠杆菌的抗菌性能

2.2 抑菌率

使用不同质量浓度的抗菌整理剂整理棉、涤纶织物，在两种不同培养基制备方法下得到的抑菌率如图2所示。

图2 抗菌试样的抑菌率

实验所得细菌增长值均大于等于1.5，可以判定 实验有效。抑菌率偏差如表1所示。

表1 两种制板方法的抑菌率偏差

由图2、表1可以看出，在使用振荡法对抗菌试样进行抗菌性能测试的实验过程中，最后制作琼脂平板时使用倒板法或划板法所得到的抑菌率相差不大，划板法所得到的抑菌率结果比倒板法略高一些。两种不同的制板方法对大肠杆菌的抑菌率影响相对较大，抑菌率偏差接近5%；对金黄色葡萄球菌的抑菌率影响则相对较小，抑菌率偏差不超过3%。特别是在抗菌效果优异（抑菌率达到99.99%）时，抑菌率没有差别。因此，这两种制板方法都是可行的，实际操作时可根据自身需要选用。

3 结论

本实验选用最具有代表性的革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）为实验菌种，对最常见的涤纶和棉织物采用振荡法测试抗菌性能。结果表明，在抗菌测试的过程中，划板法和倒板法两种制板方法都是可行的，得到的抑菌率偏差不超过5%。使用划板法制作的琼脂板，其生长的细菌菌落数量较少，并且菌落长得较大，便于观察和计数，但制板时在琼脂板表面涂布菌液的过程费时费力。使用倒板法制作琼脂板操作简便，但是其生长的菌落较小，并且数量多，不便于计数。另外，制板时必须注意液态琼脂的温度，温度过高会杀死菌液中的细菌，温度过低琼脂会凝固结块，无法与菌液均匀混合，两者都会使实验产生较大误差甚至失败。综上所述，在进行抗菌测试时，可以根据实验环境和条件选择合适的培养基制备方法。