不同剂量朱砂对睡眠剥夺前后大鼠的GABA和血汞的影响

陈铭奇 黄俊山 曾雪爱 王秀峰 张瑜

(福建省中医药科学院，福建省中医睡眠医学重点实验室，黄俊山福建省名老中医药专家传承工作室，福州，350003)

随着对冬奥冠军谷爱凌的报道，10 h睡眠成了大众关注的热点。近年来由于社会的快速发展，工作节奏越来越快，再加上疫情给大众生活和工作带来的压力，越来越多的人正受到睡眠剥夺(Sleep Deprivation，SD)的威胁。睡眠剥夺是指各种原因所致的睡眠减少或睡眠时间严重不足，主要与睡眠时间和睡眠类型异常明确相关，包括完全睡眠剥夺、长期睡眠受限及睡眠片段化[1]。睡眠是人体消除疲劳，维持注意力和认知能力的重要途径[2]。睡眠受多种神经递质调节，包括兴奋性神经递质如多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)及抑制性神经递质如γ-氨基丁酸(GABA)。现代研究表明GABA是中枢神经系统中重要的抑制性递质，产生镇静催眠作用[3]。朱砂作为传统中药有良好的安神定志、清心解毒的功效，使其在中医临床治疗失眠的过程中具有不可替代的地位。而对朱砂毒性的认识经历了《神农本草经》时的“无毒”到明清时代的“有毒”，再到当今的“限量”使用。硫化汞是朱砂的主要成分，硫化汞存在β和α 2种晶形，红色的α型硫化汞微粒粒径约为6～10 μm，性质稳定，是朱砂中硫化汞的主要晶形，在体内可发生酸效应和络合效应[4]。目前关于朱砂镇静安神的研究多集中在毒性研究和一次性服药后的药时曲线，对于朱砂发挥重镇安神作用是否通过GABA进行调节，以及连续多日服用外周血汞浓度变化方面的研究较少。综上所述，本研究将对不同剂量的朱砂对睡眠剥夺大鼠γ-氨基丁酸(GABA)的调节作用以及连续7 d的治疗期内外周血汞的代谢曲线进行观察，为临床更好应用朱砂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性(Sprague-Dawley，SD)大鼠，SPF级，体质量(260±20)g，50只，由上海斯莱实验动物有限公司提供，饲养于福建省中医药科学院动物实验室，实验室温度控制在20～25 ℃，湿度在50%～60%，12 h:12 h固定照明节律，普通维持饲料喂养，自由进食饮水。大鼠购入后适应性饲养3 d后开始实验。

1.1.2 药物 朱砂(亳州市京皖中药饮片厂，水飞炮制品)，根据历版朱砂用量，本项目将朱砂剂量分为3种：0.1 g作为Ⅰ低剂量组的用量，0.5 g作为Ⅱ中剂量组的用量，1.5 g作为Ⅲ高剂量组的用量，大鼠用量为成人6倍(按体质量计算)。

1.1.3 试剂与仪器 大鼠GABA ELISA试剂盒(上海酶联生物研究所)。大鼠脑立体定位仪(美国Stoelting公司)、BP211D电子天平(德国Sartarius)、超纯水系统(美国MilliPoreTGL-16B)、高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、改良多平台水环境睡眠剥夺装置、MA-3000汞分析仪；酶标仪(美国BioTek，800TS)。

1.2 方法

1.2.1 睡眠剥夺大鼠模型复制 改良多平台水环境法进行睡眠剥夺大鼠造模。在直径80 cm的水箱内放高6 cm，直径3 cm的圆形小平台12个，每个平台间隔15 cm，箱内注水后水面低于平台1 cm，水箱顶部用铁丝网盖住，大鼠可自由进食、饮水、活动，进入睡眠时由于骨骼肌的松弛会掉入水中惊醒造成睡眠剥夺。每日换水添食，室温保持在23～25 ℃，并给予每天24 h拟光照环境。

1.2.2 实验动物分组和给药 将睡眠剥夺成功的50只大鼠随机分为3组：空白组10只、模型组10只、朱砂高、中、低剂量观察组各10只。根据《中华人民共和国药典》2015年版，本项目将朱砂剂量分为3种：0.1 g作为低剂量观察组的用量，0.5 g作为中剂量观察组的用量，1.5 g作为高剂量观察组的用量，大鼠用量为成人6倍(按体质量计算)。采用随机法分3个剂量组，用散剂混合蒸馏水灌胃。各组均按15 mL/kg体质量灌胃，每天09:00灌胃1次，共7天。模型组：10只，用蒸馏水灌胃。

1.2.3 采样 本实验采用微透析技术将透析探针埋入动物的脑中，透析探针可除去分子量大于30 000的分子，对周围组织损伤很小，取样量少，对实验动物的生存率有所保障。雄性SD大鼠以水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉，固定在立体定位仪上，将透析套管定位于右侧纹状体(前囟前0.2 mm，旁开3.5 mm，皮层下5.2 mm)并用小螺钉固定。开启透析灌流系统，调节恒流泵控制液流速30 μL/min，透析探针与人工脑脊液灌流系统直接相接。灌流平衡120 min后，每15 min收集1管，每管30 μL，共收集3管透析液。收集的透析液立即放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 实验及指标的观察

1.2.4.1 给药前后各组一般状况 观察睡眠剥夺7 d后及朱砂治疗7 d后各组大鼠的毛色光泽，精神情绪，体质量变化等情况。

1.2.4.2 ELISA检测脑脊液和血液中GABA含量 给药结束后第2天，各组大鼠麻醉后眼眶采血及脑脊液微透析，每只独立分装在冻存管，-20 ℃冰箱贮存待检。随后根据ELISA说明书检测GABA含量。

1.2.4.3 EPA7473热分解齐化原子吸收光度法检测连续7 d血汞含量 给药开始后第2天起，每天上午09:00对高、中、低剂量组大鼠进行眼眶采血，离心保存在-80 ℃冰箱待检。然后根据EPA7473热分解法进行汞原子检测。

2 结果

2.1 给药后各组一般情况 空白组大鼠精神活泼、活动规律；模型组出现明显失眠特征，表现为白天夜晚活动频繁、睡眠减少、精神疲惫，对外界声光刺激异常敏感、情绪易激、攻击性强，且皮毛失去光泽毛流散乱，体形消瘦、体质量明显减轻。观察组一般行为状态较模型组有所改善，精神较好、活动较规律。与空白组比较，模型组、低剂量观察组、水观察组大鼠体质量显著性降低(P<0.01)；与模型组比较，高、中剂量观察组大鼠体质量均有明显增加(P<0.01)；与水观察组比较，高、中、低剂量观察组体质量有明显增加(P<0.05)。见图1。

图1 不同观察组大鼠的体质量比较

2.2 外周血中GABA含量变化 与空白组比较，模型组和不同剂量朱砂观察组的大鼠血液中GABA含量未见明显变化(P>0.05)。

2.3 脑脊液中GABA含量变化 与空白组比较，模型组、高、中、低剂量观察组和水观察组大鼠脑脊液中GABA的含量显著减少(P<0.01)；与模型组比较，空白组、高、中、低剂量观察组和水观察组大鼠脑脊液中的GABA含量不同(P<0.01)；与水观察组比较，高剂量观察组的大鼠脑脊液有明显差异(P<0.01)。见图2。

图2 不同观察组大鼠脑脊液中GABA含量比较

2.4 观察组外周血中汞含量变化 观察组在连续服用不同剂量朱砂5 d内血汞浓度总体呈上升趋势，以高剂量组最明显，低剂量组次之，中剂量组最慢(P<0.01)。到第7天后血汞浓度总体有下降趋势，高剂量组的大鼠血汞含量较中、低剂量组显著升高(P<0.01)。见图3。

图3 观察组连续7 d的血汞含量变化曲线

3 讨论

本研究发现，睡眠剥夺对大鼠的情绪状态和体质量的改变是非常明显的并且难以自行恢复，这与朱寅秋的研究结果相符[5]。有研究发现，急性睡眠剥夺与睡眠抑制均会使个体变得更易怒[6]，产生更多抑郁焦虑的消极情绪[7]。尽管经过朱砂的治疗情绪障碍和体质量能够改善，但相比睡眠剥夺给身体和情绪造成的伤害其治疗作用还是相对比较有限的。根据《2020年中国人睡眠质量报告》显示近3亿中国人睡眠质量差，近67.24%的人出现失眠症状。经历了疫情后，中国人入睡时间延迟了2～3 h。这是一个非常严重的问题，并且需要立即得到关注与干预。睡眠剥夺包含了各种自发的和被动造成的睡眠缺失状态。长期的睡眠剥夺不仅造成机体生长发育的不良、情绪心理障碍，同时也可能是年轻人猝死的一个重要因素。

本研究发现，睡眠剥夺能够使大鼠脑脊液中GABA含量显著降低，并且在后期也较难自行恢复，可见睡眠剥夺对大脑的损伤是显著的、不可逆的。而高剂量的朱砂治疗能够使脑脊液中GABA含量有较明显的改善，但作用有限。这与以往实验研究报道结果相符[8]。γ-氨基丁酸(GABA)作为脑内主要的抑制性神经递质，是由L-谷氨酸在谷氨酸脱羧酶(GAD)作用下脱羧形成，对中枢神经元有普遍抑制和调节作用[9]。另外本研究发现，睡眠剥夺对大鼠外周血中GABA含量的改变无显著差异。已有研究发现除了神经系统外，GABA还广泛分布于脂肪、肝脏、肌肉等外周组织[10]。这可能与外周组织的调控有关，外周血中的GABA含量能够受到外周组织调控而保持相对稳定。

本研究发现，中、低剂量朱砂对脑脊液中GABA含量不能起到明显的调节作用；只有高剂量朱砂能够较明显促进脑脊液中GABA生成；但连续7 d朱砂治疗显示的高剂量朱砂能够使外周血中汞含量明显高于中、低剂量组。这可能说明了GABA并不是朱砂改善睡眠的主要作用靶点。现代研究发现[11-13]朱砂除对GABA有影响外，朱砂还可降低其他兴奋性神经递质如5-HT、NE、天冬氨酸、甘氨酸含量。王旗等[14]通过小鼠高架水迷宫试验证实了朱砂有抗焦虑作用。测定小鼠脑内单胺类神经递质及其代谢产物发现，朱砂对5-HT有剂量依赖性抑制作用，但对DA和NE无明显影响。

朱砂作为中医重镇安神药中的典型代表，以其“色赤通心，重能镇怯，寒能胜热，甘以生津，抑阴火之浮游，以养上焦之元气，为安神之第一品。”现代临床研究也证实了朱砂及其复方在镇静催眠、抗焦虑、抗恐惧、外用消炎等具有良好疗效，但在临床口服多以复方配伍使用，单味药口服较少即使低剂量口服也不能保证其安全性，其发挥作用的主要靶点在脑组织中，其浓度与安全剂量、蓄积代谢的药代动力学还有待进一步验证，其解毒方面的研究将是后面的主要研究方向。