丹参酮胶囊对咪喹莫特诱导的银屑病模型小鼠的抗炎和抗氧化应激作用

徐霞 周欣 梁景耀 彭丽倩 李仰琪 林春生 万长兰 李振洁 李润祥 叶兴东

广州市皮肤病防治所皮肤科，广州 510095

银屑病是一种遗传与环境共同作用诱发的免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病。目前治疗寻常型银屑病的传统药物主要有环孢素、甲氨蝶呤、阿维A等，但传统药物的不良反应较多。虽然一些针对银屑病发病机制中关键炎症因子的生物制剂［如肿瘤坏死因子（TNF）-α抑制剂和白细胞介素（IL）-17A拮抗剂］已应用于临床，并取得了良好的效果，但这些生物制剂价格昂贵，而且银屑病合并炎症性肠病、结核、肝炎的患者禁用［1］。因此，探索新的有效、不良反应少且经济的治疗药物仍然是银屑病领域研究的重点和热点。

免疫学异常是银屑病发病的中心环节，TNF-α–IL-23–Th17炎性反应通路在T细胞介导的斑块型银屑病中起着重要作用［2］。此外，越来越多的研究表明机体氧化应激水平的增高在银屑病的发生发展中起到关键作用［3］。银屑病皮损中存在核因子E2相关因子-2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）水平下调，其下游的人血红素加氧酶1（heme oxygense-1，HO-1）水平下降［4］。在银屑病皮损处，角质形成细胞和浸润的炎症细胞产生过量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［5］，ROS可作为第二信使参与调控、活化细胞膜等相关信号转导通路，诱导细胞发生增殖和分化［6］。丹参酮（亦称总丹参酮）是唇形科植物丹参根部的提取物，属于二萜醌类化合物，包括隐丹参酮、二氢丹参酮、丹参酮-Ⅰ、丹参酮Ⅱ-A等有效成分，国内外研究表明其具有较强的抗炎、抗肿瘤、免疫调节作用［7］。研究发现，丹参酮通过降低衰老模型小鼠皮肤中脂质过氧化代谢产物丙二醛含量，增加超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，从而发挥抗氧化作用［8］。但在银屑病中，丹参酮胶囊是否通过抗炎和抗氧化应激发挥作用目前尚未清楚。因此本研究拟通过构建咪喹莫特（imiquimod，IMQ）诱导的银屑病样小鼠模型，探讨丹参酮胶囊对银屑病的治疗作用及其对银屑病发病机制中关键炎症因子和氧化应激反应的影响，揭示其治疗作用机制，为其用于银屑病治疗提供实验依据。

材料与方法

1、试剂与仪器

（1）试剂：IMQ乳膏（美国Sigma公司），酶联免疫吸附实验（ELISA）稀释液（美国eBioscience，San Diego，CA），血清TNF-α和IL-17A的ELISA检测试剂盒（美国eBioscience公司），丹参酮胶囊（河北兴隆希力药业有限公司），抗体Nrf2［ab76026，abcam，艾博抗（上海）贸易有限公司］，抗体HO-1［ab52947，abcam，艾博抗（上海）贸易有限公司］，抗体SOD2［ab68155，abcam，艾博抗（上海）贸易有限公司］，免疫组化试剂盒［RE7280-CN，澳泉（AQ），中山市澳泉医疗科技有限公司］，Evo M-MLV RT逆转录试剂盒（AG11705，ACCURATE BIOTECHNOLOGY，HUNAN，Co.，Ltd），SYBR Green Premix Pro Taq HSqPCR Kit（AG11701，ACCURATE BIOTECHNOLOGY，HUNAN，Co.，Ltd）。（2）仪器：酶标仪（BioTek Synergy HTX，Agilent Technologies Inc，美国），光学显微镜（Olympus D72，Olympus Corporation，日本），LC480荧光PCR仪（LC480，Roche，美国），全自动脱水机（Leica TP1020，Leica，德国），包埋机（Arcadia，Leica，德国），切片机（Leica RM2125RTS，Leica，德国），全自动H&E（苏木精-伊红）染色机（Leica EM AC20，Leica，德国）。

2、动物饲养与分组给药

Balb/C小鼠购自广东省医学实验动物中心［许可证号：SCXK（粤）2018-0002］，雄性，体质量18～22 g，用标准饮食和水喂养。实验采用8周龄的小鼠，随机分成3组：正常组、模型组和丹参酮胶囊组，每组3只。所有的体内实验根据实验动物研究委员会指南和机构动物保护和使用委员会的规定批准的。剃除小鼠背毛露出2 cm×3 cm的皮肤区域，正常组小鼠每天背部涂抹凡士林，模型组和丹参酮胶囊组小鼠背部涂抹IMQ乳膏60 mg/d，共14 d。与此同时正常组和模型组给予腹腔注射生理盐水，丹参酮胶囊组通过灌胃方式给予丹参酮胶囊内容物［1 500 mg/（kg·d）］，分3次灌服，每天1次，连续8 d。于第8天，背部皮肤拍照后摘除眼球取血，脱颈处死，取皮损组织。血液室温静置30 min，2 000×g离心10 min，分装后保存于-80℃冰箱中。

3、小鼠背部皮肤银屑病表型的监测及评分

借鉴临床上使用的银屑病PASI评分标准，对小鼠背部皮肤的炎性反应程度进行评估。实验期间由同一人进行评估，评估内容包括红斑、鳞屑和増厚。评估内容的评分标准如下：0＂无现象＂；1＂轻微＂；2＂中度＂；3＂显著＂，4＂十分显著＂。总分的得分为红斑、鳞屑以及增厚各项评分之和，以总分评估炎症严重反应程度。

4、组织学分析

将受试区皮肤置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，进行脱水、石蜡包埋、切片，然后对石蜡切片进行HE染色。使用光学显微镜检查观察皮肤组织病理学变化。

5、ELISA

血液经离心机2 000×g离心10 min，产生血清样本。血清样本用ELISA稀释液（eBioscience，San Diego，CA，USA）稀释10倍。根据ELISA试剂盒说明书（eBioscience），测定血清TNF-α和IL-17A浓度。使用BMG酶标仪测量450 nm和540 nm处吸光度，根据标准曲线计算浓度。

6、数据分析

试验数据为计量资料，符合正态分布，用均数±标准差（±s）表示。试验结果采用SPSS软件18.0（芝加哥，美国）软件统计分析，采用单因素方差分析各组间的差异。P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1、丹参酮胶囊改善IMQ诱导的银屑病小鼠的形态学特征

与正常对照小鼠相比，IMQ外擦5 d后小鼠背部出现银屑病样病变症状，如出现红斑、鳞屑增多以及皮肤增厚（图1）。与IMQ组相比，丹参酮胶囊处理组小鼠背部皮损红斑减轻、鳞屑减少、皮肤厚度变薄，并且银屑病PASI评分下降（P<0.05）（图2）。HE染色显示IMQ诱导组小鼠背部皮肤出现表皮增生，棘层增厚，丹参酮胶囊处理组表皮层厚度显著降低（图3）。以上结果提示丹参酮胶囊可以改善IMQ诱导的银屑病样小鼠的皮损，降低表皮厚度，说明其对银屑病样皮损有治疗效果。

图1 各组小鼠皮肤外观

图2 丹参酮胶囊显著减轻银屑病样小鼠的红斑（A）、鳞屑（B）、皮肤厚度（C）以及PASI评分（D）

图3 A为HE染色观察小鼠皮肤病理变化（原始放大倍数，顶部40×，底部200×）；B为显微镜下测定表皮厚度

2、丹参酮胶囊降低银屑病样小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平

IL-17A和TNF-α是银屑病发病过程中的关键细胞因子，为了探讨丹参酮胶囊对这两个关键细胞因子表达是否有影响，我们检测了小鼠血清中IL-17A和TNF-α的水平。与正常对照组相比，IMQ诱导的银屑病样小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平升高，而丹参酮胶囊处理后可以降低银屑病样小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平（图4）。

图4 丹参酮胶囊降低银屑病样小鼠血清中IL-17A（A）和TNF-α（B）的水平

3、丹参酮胶囊在银屑病样小鼠中的抗氧化作用

实时荧光定量PCR结果显示，IMQ诱导后，组织中Nrf2、HO-1、SOD2和NAD（P）H醌氧还原酶-1［NAD（P）H quinoneoxid oreductase 1，NQO1］的mRNA水平显著降低，丹参酮胶囊处理后，银屑病样小鼠组织中Nrf2、HO-1、SOD2和NQO1的mRNA水平明显升高（图5）。免疫组化染色也显示丹参酮胶囊增加了IMQ诱导的银屑病小鼠皮肤组织中Nrf2、HO-1和SOD2的表达（图6）。以上结果提示丹参酮胶囊在银屑病样小鼠中具有抗氧化作用。

图5 丹参酮胶囊诱导Nrf2（B）及下游基因HO-1（A）、SOD2（C）和NQO1（D）的mRNA转录

图6 丹参酮胶囊诱导Nrf2（B）及下游蛋白HO-1（A）和SOD2（C）的表达

讨 论

银屑病是一种常见的慢性、复发性的炎症性疾病，发病机制复杂。角质形成细胞增殖和分化的异常，角质层中性粒细胞聚集所形成的Munro微脓疡以及真皮浅层血管周围以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润是银屑病的3个最主要的病理特点［9］。最近的研究表明，一些突变可能导致免疫系统异常活跃系统，从而导致炎性反应增强以及随之而来的氧化应激反应［10］。

既往研究显示，Th1细胞介导的炎性反应、Th17细胞活化及IL-23/IL-17轴参与了IMQ诱导的小鼠银屑病样皮损的形成［11］。此外，有研究者发现IMQ诱导的小鼠银屑病样模型中也存在异常的氧化-抗氧化系统，例如髓过氧化物酶水平升高，SOD活性降低［12］。因此，我们选择这一模型用于研究丹参酮胶囊的抗炎和抗氧化作用。IMQ外擦5 d后，小鼠背部出现银屑病样病变症状，包括红斑、鳞屑、皮肤增厚。组织病理学检查也证实小鼠背部皮肤表皮棘细胞层明显增厚。我们用ELISA检测发现IMQ诱导的银屑病样小鼠血清中TNF-α和IL-17A水平较正常对照组升高，这与银屑病患者血清中TNF-α和IL-17A的水平升高相一致［13-14］。此外本研究也发现银屑病样小鼠组织中Nrf2、HO-1、SOD2和NQO1的mRNA水平显著降低，揭示银屑病样模型小鼠中存在抗氧化应激反应减弱。氧化应激可通过多种信号通路促进炎性反应，包括NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和信号转导和激活因子3（STAT3）转录［2，4］。因此，我们推测银屑病样小鼠体内可能由于抗氧化应激能力减弱，导致过量的ROS不能被清除，增强了MAPK/AP-1、NF-κB和JAK-STAT等信号通路转导，使得炎症因子及趋化因子表达增多，从而对角质形成细胞的增殖与分化产生影响。

丹参酮胶囊处理后银屑病样小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平下降。本研究提示丹参酮胶囊可以降低银屑病发病过程中的关键细胞因子IL-17A和TNF-α的水平，从而对银屑病的炎症水平造成影响。TNF-α是一种在炎症和自身免疫性疾病中具有广泛生物学活性的细胞因子，它可诱导血管内皮细胞产生炎症介质，通过多种方式直接或间接地诱导银屑病的病理发生。使用TNF-α受体拮抗剂依那西普可以降低斑块型银屑病患 者 体 内IL-1、IL-8、干 扰 素（IFN）-γ诱导蛋白（CXCL10）和巨噬细胞炎性蛋白-3a（CCL20）mRNA的表达，从而分别引起中性粒细胞、T淋巴细胞和树突状细胞浸润减少［15］。IL-17A被认为是建立和维持银屑病表型的关键细胞因子。IL-17A通过结合角质形成细胞、树突状细胞、皮肤纤维母细胞和内皮细胞上的IL-17A受体而发挥作用［16］。IL-17A可以激活皮肤角质形成细胞促进其增殖，亦可促进角质形成细胞释放趋化因子从而导致中性粒细胞和可产生IL-17A的CCR6+免疫细胞的募集［17］。此外，IL-17还可与TNF-α等炎症因子协同，放大加强其致炎效应［18］。

机体氧化与抗氧化的平衡有多种机制参与，其中Nrf2是启动抗氧化反应的关键核转录因子，Nrf2激活剂可上调其下游的抗氧化酶基因如HO-1、SOD、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶等和Ⅱ相解毒酶如NQO1、谷胱甘肽S转移酶、葡糖醛酸羧基转移酶等靶基因。国外Ⅲ期临床试验显示二甲基延胡索酸对中、重度银屑病患者有较强疗效［19］。二甲基延胡索酸对银屑病的治疗作用与其可通过激活Nrf2，上调谷胱甘肽、诱导抗氧化基因的表达，进而减少ROS的产生相关［5］。因此，纠正银屑病患者体内异常的氧化应激，是银屑病治疗的潜在靶点。Tao等［20］对紫外线光损伤的研究，发现总丹参酮中的丹参酮-Ⅰ、二氢丹参酮、丹参酮Ⅱ-A和隐丹参酮可以通过激活Nrf2，诱导角质形成细胞内NQO1和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因表达，增加细胞内谷胱甘肽的水平。因此，我们推测丹参酮胶囊可能可以通过激活Nrf2在银屑病模型中发挥抗氧化应激作用。我们的研究结果也显示丹参酮胶囊可以增加银屑病样小鼠皮肤组织中Nrf2、HO-1、SOD2和NQO1的mRNA水平，免疫组化也证实HO-1、SOD2和Nrf2的蛋白水平表达增加。以上研究提示丹参酮胶囊可以通过激活Nrf2及其下游抗氧化基因从而在银屑病样小鼠模型中发挥抗氧化应激作用。

综上所述，丹参酮胶囊对小鼠银屑病样病变症状的改善作用，与其可降低血清中IL-17A和TNF-α的水平及激活Nrf2通路发挥抗氧化应激作用相关。由于丹参酮胶囊是复合成分，后续可进一步对其中的单体进行研究，筛选出对银屑病模型治疗具有最佳效果的单体及其合适的剂量。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突