刘昊宇,郑友,丁淑燕,刘国兴,,史杨白*,孙龙生*
(1.扬州大学动物科学与技术学院,江苏 扬州 225009;2.江苏省淡水水产研究所,江苏 南京 210017)
溴氰菊酯(Deltamethyrin,DM),别名敌杀死,化学式为CHBrNO,是一种II型拟除虫菊酯杀虫剂,为菊酯类杀虫剂中毒力较高的一种,具有触杀和胃毒作用,触杀作用迅速,击倒力强,其杀虫毒力比其他拟除虫菊酯大5~10倍。在水产养殖上,DM主要防治常见淡水鱼类体表锚头鳋、中华鳋、鱼鲺等甲壳虫类寄生虫和控制有害水生昆虫过度增殖,杀虫持效期长达7~12 d。但在病害防治过程中,溴氰菊酯残留率较高,对水产动物的毒性较大,使用不当极易中毒。
河川沙塘鳢()是一种淡水底栖型鱼类,广泛分布在长江中下游及其沿江支流。近年来,随着河川沙塘鳢人工苗种培育技术的突破,养殖规模显著提升,其养殖模式主要以套养为主,是一种极具潜力的经济养殖品种。河川沙塘鳢对生存环境要求较高,对外界环境改变较敏感。菊酯类药物对水生动物危害性的是近年来的研究热点之一,其对大型蚤以及虾蟹类的危害均有报道,对鱼类危害的研究主要集中在四大家鱼以及海水鱼等品种,对河川沙塘鳢的毒性方面的研究较少。于2021年10月开展了溴氰菊酯对河川沙塘鳢的毒性效应试验,旨在为水生动物疾病的预防、诊断与治疗和可持续型淡水养殖业的发展提供依据。
试验地位于江苏省淡水水产研究所扬中基地,选择经大规格苗种培育后放入塘口养殖3~4个月的沙塘鳢,均为同批次孵化,其体表光滑,体格健壮,平均体长(10.5±2.0)cm、平均体质量(30.0±5.0)g。驯养时间为1周。试验前1 d停止投饵,对残饵作吸污处理。
DM原药购自拜耳作物科学有限公司,有效含量为25 g/L,剂型为乳油。
河川沙塘鳢在实验室蓝色塑料水箱(60 cm×44 cm×36 cm)内暂养3 d后,开始急性毒性试验。室内温度为(22.0±2.0)℃。水箱内分别注入30 L经曝气7 d以上的自来水,溶解氧为(8.0±1.0)mg/L,pH值为(7.0±0.5),试验期间不投饵。
1.4.1 半致死浓度暴露
根据静态测试法,试验期间不更换试验液,参照试验药物的常用剂量,先进行预试验,设置5个浓度组,并进行空白对照。根据预试验结果设置6个梯度组(0、2、4、6、8、10μg/L),每个水箱投放河川沙塘鳢10尾,每个浓度设置3个平行。在试验开始后的24 h内,河川沙塘鳢药物暴露后每4 h观察一次其中毒症状。在24 h、48 h、72 h和96 h时记录鱼的死亡率。鱼是否死亡的判断标准是观察其鳃盖是否在活动,并用玻璃棒轻触尾柄观察是否有应激反应,经多次刺激其无反应,则判定为死亡。
1.4.2 组织病理学观察
根据急性毒性试验结果,依照上述同等试验条件,设置3个浓度梯度(0、10、20μg/L)进行暴露处理。72 h之后,每个浓度处理组各取3尾鱼,吸干体表水分,用乙醇轻轻擦拭体表进行消毒,并迅速解剖分离鳃和肝组织,用PBS磷酸缓冲液清洗,吸干表面液体后放入离心管中,加入Bouin’s固定液固定24 h,待石蜡切片制作。固定好的组织径流水冲洗、脱水、二甲苯中透明2次后进行浸蜡2 h,包埋于石蜡中,用KD-1508A切片机切片,切片厚度为5μm,脱蜡复水,苏木精-伊红染色,最后用树脂胶封片,在显微镜下观察组织病理情况,并拍照分析。
1.4.3 组织生化指标测定
根据急性毒性试验结果,依照上述同等试验条件,设置4个浓度梯度(0、5、10、20μg/L)进行暴露处理。每个浓度组在24 h、48 h、72 h、96 h时各取3尾鱼,快速将其捞出,避免外界环境因素影响,并用湿毛巾包裹,分离其鳃及肝脏,用PBS磷酸缓冲液洗濯,清除血迹,转入到冻存管中,在-70℃冰箱中保存。从冰箱取出后转入到离心管中,加入PBS匀浆,于3 000 r/min离心15 min,取上清液转入离心管中,用于测定肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量以及鳃Na/K-三磷酸腺苷(ATP)酶活性,测定方法按照南京建成生物公司的检测试剂盒说明书。
统计试验鱼在96 h的死亡数,并计算其死亡率。采用寇氏(Korbor)法计算DM对河川沙塘鳢的96 h的半致死浓度(LC和安全浓度,结果以“平均数±标准差”表示。用SPSS19.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),采用Duncan法进行多重比较,<0.05代表组间数据差异显著,采用Excel2016作图。
试验期间,空白对照组未发现有中毒的沙塘鳢,而10μg/L浓度组的沙塘鳢在暴露2 h后反应激烈,出现狂躁以及撞壁现象。暴露8 h后,8μg/L浓度组的2条沙塘鳢开始出现反应迟缓、身体向一侧倾斜、无法平衡的症状。12 h后,2个高浓度组(10和20μg/L)的沙塘鳢分别有1条失去行动能力,腹部朝上,躺卧在箱底,用玻璃棒轻触之后,又重新开始缓慢游动,但1~2 min之后又慢慢沉入水底。18 h后,10μg/L组有2条鱼鳃盖活动缓慢,时而张开,时而闭合,尾部也在缓慢挪动,侧躺卧在水底。24 h后,8和10μg/L组的沙塘鳢开始出现死亡现象,鳃盖张开,鱼头朝下,用玻璃棒轻触多次均无反应,查看死亡后的沙塘鳢,发现其眼球凸起。
DM对河川沙塘鳢的急性毒性试验结果见表1。由表1可见,96 hDM对河川沙塘鳢的LC为5.29μg/L,安全浓度为0.53μg/L。依据《危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法》(GB 21281—2007)判断,DM对河川沙塘鳢有剧毒。
表1 DM对河川沙塘鳢的急性毒性试验结果
DM对河川沙塘鳢鳃Na/K-ATP酶活性的影响见图1,图中同组数据肩标无字母或字母相同表示差异不显著(>0.05),字母不同表示差异显著(<0.05)。由图1可见,空白对照组随着暴露时间增加,其Na/K-ATP酶活力趋于稳定。低浓度组(5μg/L)Na/K-ATP酶活性与对照组(0μg/L)相比差异不显著,而高浓度组(10和20μg/L)在72、96 h暴露下,Na/K-ATP酶活力比对照组显著下降。
图1 DM对河川沙塘鳢鳃Na+/K+-ATP酶活性的影响
20μg/L DM暴露72 h后河川沙塘鳢鳃的组织病理变化见图2(a)(b)(c)(d)。由图2可见,未受DM暴露正常沙塘鳢的鳃小片结构清晰,平缓严整,没有出现扭曲、增生、脱落的现象,也没有血管扩张导致淤血的现象。鳃丝中的上皮组织细胞有序排列,细胞核的结构形状也较为完整[图2(a)(b)]。20μg/L的药物暴露72 h之后,鱼鳃小片出现扭曲,鳃小片毛细血管扩张充血,鳃丝紊乱,上皮细胞和柱状细胞脱落,一些细胞核破裂,黏液细胞增生甚至出现鳃丝断裂、脱落现象[图2(c)(d)]。
图2 20μg/L DM暴露72 h后河川沙塘鳢鳃的组织病理变化
DM对河川沙塘鳢肝脏SOD和CAT活性、MDA含量的影响见图3(a)(b)(c)。图中同组数据肩标无字母或字母相同表示差异不显著(>0.05),字母不同表示差异显著(<0.05)。由图3可见,与对照组相比,低浓度组(5μg/L)经96 h暴露,试验鱼肝脏SOD活性有了明显提升,高浓度组(10和20μg/L)经72 h和96 h暴露,SOD活性均呈显著下降。低浓度组(5μg/L)暴露24 h时CAT活性迅速上升,高浓度组(10和20μg/L)CAT活性则显著降低(<0.05),10μg/L组暴露48 h后CAT活性显著上升,20μg/L组CAT活性则先降低后恢复正常。低浓度组(5μg/L)鱼肝脏MDA含量呈现先升高后降低趋势,而中高浓度组MDA含量随暴露时间延长总体呈现明显增高。
图3 DM对河川沙塘鳢肝脏SOD和CAT活性、MDA含量的影响
20μg/L DM暴露72 h后河川沙塘鳢肝脏的组织病理变化见图4(a)(b)(c)(d)。由图4(a)(b)可见,病理组织学观察结果表明,未受过DM急性暴露正常沙塘鳢肝脏组织细胞形态呈现多角形,结构完整,细胞核为圆形,大小一致,细胞间界限清晰,细胞质较丰富。由图4(c)(d)可见,20μg/L的处理组暴露72 h之后,肝细胞间隙增大,肝脏肝窦有出血扩张现象,肝细胞体积缩小,细胞间界限变得模糊,细胞核退化甚至消失,细胞质经伊红染色表现深红色,上皮细胞排列疏松呈现空泡样。
图4 20μg/L DM暴露72 h后河川沙塘鳢肝脏的组织病理变化
总体来看,DM对一般水生动物都有剧毒,不同水生动物对DM的毒性效应存在一定差异。Prusty等报道DM对翠鳢()96 h LC是0.75μg/L。周兵等通过研究后得出DM对孔雀鱼和月光鱼的96 h LC分别为0.23 mg/L、0.35 mg/L。本研究中,DM对河川沙塘鳢的96 h LC是5.29μg/L,与相关报道差异较大,原因可能与试验动物种类、年龄、体质量存在联系。另外,药物对鱼类毒性的影响因素还与诸如气温、气压、湿度、季节等环境因素的差异等均有关系,故评价药物的毒性还需要根据其他毒理生化指标进行综合评价。
DM属于高亲脂性杀虫剂,不易溶于水,但鱼类的吸收率较高,DM特别容易被鳃吸收,影响鳃的功能,导致鳃形态和结构受到不同程度的损伤,甚至细胞破裂凋亡。本研究中,沙塘鳢受高浓度DM(10、20μg/L)暴露72 h以上,鳃Na/K-ATP酶活性显著下降。有研究用甲氰菊酯急性暴露于鲢,结果显示鳃组织中Na/K-ATP酶的活性也呈下降趋势,鳃组织中的氯细胞被破坏可能造成了Na/K-ATP酶活性的降低。除菊酯类农药外,也有研究表明其他成分如微量元素也有类似的抑制作用,张清雯等用微量元素镧和硒作用于条纹锯鮨,Na/K-ATP酶活性随时间呈极显著抑制。Na/K-ATP存在于鳃组织的氯细胞中,而氯细胞存在于鳃小叶基部,在高浓度药物的胁迫下,Na/K-ATP酶系统被破坏,鳃组织Na/K-ATP酶活性下降,鱼体的离子代谢和渗透平衡功能丧失,细胞发生变性甚至坏死。
鳃组织细胞的病变和功能丧失是DM导致沙塘鳢致死的关键原因之一。组织病理学观察显示,DM对沙塘鳢的鳃组织造成了明显的组织损伤,鳃的呼吸、转化、代谢等生理功能减弱或丧失,进而鱼类呼吸以及排泄等功能受阻,出现缺氧现象。有研究表明类似缺氧现象会影响机体其他组织器官的正常生理功能,严重时则会导致鱼类死亡。药物急性暴露下,鳃结构的紊乱,鳃小片细胞的增生,减少了吸收氧的有效面积,呼吸系统遭到破坏,肝脏和肾脏失调,鱼体内大量有害气体不能及时排出,鱼体会“间接中毒”。
鱼类的肝脏是维持鱼体稳定内循环和新陈代谢的关键器官,是调节、排泄外来有害物质的主要场所,肝脏脂质氧化损伤是环境污染物导致生物死亡的一个重要原因。MDA是脂质过氧化过程的最终代谢产物,所以MDA含量的变化能够反映膜脂质氧化损伤的程度。本研究中,DM对MDA含量的变化呈现明显的剂量效应和时间效应,高浓度长时间接触DM,沙塘鳢肝脏出现了氧化损伤。肝脏MDA含量的增加可能与SOD酶活性的显著抑制存在关联。毒物胁迫暴露的早期,生物机体组织中相关酶活性增强,出现“毒物兴奋效应”。这种生物酶的增益现象,是机体应对环境变化产生的一种应激反应。随着暴露浓度的增大和暴露时间的延长,机体自身器官内的组织受到破坏,脂质则会严重过氧化导致鱼类损伤,导致酶活力的降低。
本研究组织病理学观察结果显示,急性暴露后,肝细胞间隙增大,肝脏肝窦有出血扩张现象,上皮细胞排列疏松呈现空泡样。肝细胞的空泡化现象是鱼类肝脏对一些药物暴露的常见反应,肝细胞中空泡增加表明肝细胞中的糖脂代谢能力降低。蒋弥对鲫的研究中也发现,被病原菌感染的鲫,其肝脏细胞核不规则,出现细胞空泡化的症状。一些关于尼罗河罗非鱼毒性效应研究发现,药物在鱼体积累和代谢的过程中产生了病理损伤,进而导致组织结构发生变化和肝脏的损坏。因此急性暴露下,肝细胞变性坏死导致鱼类肝脏药物代谢解毒功能下降甚至丧失,肝组织结构大量发生病理变化,加速鱼类死亡。
DM对河川沙塘鳢具有剧毒作用,其96 h LC为5.29μg/L,安全浓度为0.53μg/L。毒理机制可能与DM严重干扰了沙塘鳢鳃组织Na/K-ATP酶活性及肝脏细胞的抗氧化机制,进而干扰了正常的生理功能,最终导致组织结构病变,引发毒性效应有关。