泌尿清丸对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠的影响及作用机制探讨

李 斌，黄德亮，郑慧澜，蔡 强，吴 鹏，李睿舒

（荆州市中医医院，湖北 荆州 434000）

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）为中青年男性常见的生殖系统疾病，约50%的成年男性一生中某个阶段会受到该病的困扰［1］，其中慢性非细菌性前列腺炎（chronic nonbacterial prostatitis，CNP）约占前列腺炎的90%以上［2］。CNP 发病缓慢，病情反复，缠绵难愈，主要症状表现为下腹部、会阴部疼痛或盆腔不适，伴随尿频、尿急、尿痛、下尿路激惹或阻塞、性功能障碍、抑郁等［3］，严重影响患者的生活质量。临床治疗主要以α-受体阻滞剂、非甾体类抗炎药等缓解症状，但疗效不甚理想，且复发率较高［4］。中医药治疗慢性非细菌性前列腺炎具有明显特色及优势。本研究探讨泌尿清丸对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠的影响及其作用机制，旨为中医药治疗慢性非细菌性前列腺炎提供新思路。

1 实验材料

1.1动物 SD 品系大白鼠，雄性，SPF 级，体质量180～220 g，购于长江大学实验动物中心，饲养于长江大学实验动物中心清洁级动物房，动物合格证号：SCXK（鄂）2017-0012。动物自由饮水，予固体饲料饲养。饲养条件：室温18～20 ℃，相对湿度60%～70%，12 h/12 h 光照黑暗循环。实验动物管理均遵守《中华人民共和国卫生部动物实验管理条例》。

1.2试药与试剂 泌尿清丸为我院院内制剂（批文号：JZY1034），由桂枝、茯苓、泽兰、赤芍、桃仁、红花、金钱草、黄柏、石苇、猪殃殃、蒲公英、萆薢、菟丝子、三棱、莪术、王不留行、山茱萸、山药、川芎、白芍等组成。上述药材经检验均符合2020年版《中华人民共和国药典》一部各药材项下的规定。取上述药材，由我院中药室以一定比例按提取工艺进行提取、分离、浓缩、干燥，制备成丸剂，每8丸含生药3 g。IL-8（白细胞介素8，批号：AF7245）、TNF-α（肿瘤坏死因子α，批号：AF7873）、IL-1β（白细胞介素1β，批号：AF7210）、IL-4（白细胞介素4，批号：AF7230）、IL-6（白细胞介素6，批 号：AF7237）、IL-10（白 细 胞 介 素10，批 号：AF7249）、β-actin（β-肌动蛋白，批号：AF5001）单抗均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3仪器 荧光倒置显微镜（德国Leica 公司产品）；550型酶标仪（美国Bio Rad公司产品）。

2 实验方法

2.1动物分组与造模 取65 只大鼠，随机抽取10 只作为空白组，余55 只按文献［5］进行造模。大鼠腹腔注射0.6%戊巴比妥钠麻醉（30 mg/kg），剪除下腹被毛，于无菌条件下在下腹部正中切口，直达腹腔，提起膀胱及两侧精囊，暴露附于精囊内侧的前列腺背叶，缓慢注射0.1 ml 完全弗氏佐剂至前列腺组织（空白组大鼠注入0.1 ml 生理盐水），送复脏器，逐层缝合肌肉皮肤。术后每只大鼠肌注庆大霉素0.1 ml 预防感染。饲养2 周后，随机选取5 只造模大鼠，行前列腺组织病理切片后确认模型成功。造模成功后，再随机分为模型组、阳性对照组（普乐安片）和泌尿清丸低、中、高剂量组，每组10只。

2.2给药 造模成功后第7 d 各组大鼠开始给药，根据动物与人体表面积换算法计算出给药剂量。空白组和模型组灌胃给予蒸馏水；阳性对照组灌胃给予普乐安片，给药剂量为2 g/kg（相当于成人日用量的20倍），临用前用生理盐水制备成0.2 g/ml 的混悬液；泌尿清丸高、中、低剂量组灌胃给予泌尿清丸，给药剂量分别为16 g/kg、8 g/kg、4 g/kg（分别相当于成人日用量的20、10、5 倍），临用前用生理盐水分别制备成1.6 g/ml、0.8 g/ml、0.4 g/ml的混悬液。各组大鼠灌胃容积均为10 ml/kg，1次/日，连续45 d。

2.3取材方法 末次给药后禁食24 h，称大鼠体质量后以3 ml/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉，开腹后腹主动脉取血，置于抗凝真空采血管中，-20 ℃冰箱保存备用。取出前列腺称定其湿重，肉眼观察前列腺体颜色变化、有无灰白色结节及腺体与周围组织粘连等。然后将前列腺迅速横向分为2 份，一份放入10%中性甲醛中固定48 h，逐级乙醇脱水，透明、浸蜡、石蜡包埋，常规4µm 切片，HE 染色，在高倍镜（HP）下观察前列腺间质充血、水肿和间质内炎症细胞浸润情况。另一份放入液氮，冻存，备用。

2.4观察指标

2.4.1一般检查 观察大鼠状态、行为、体征。于给药前和给药后每3 天记录各组大鼠体质量，给药结束后称重前列腺质量，计算前列腺指数。

2.4.2光镜检查 组织切片：HE 染色大鼠前列腺组织，高倍镜下观察切片标本，随机选取切片标本的10个视野，在高倍镜（HP）下观察前列腺间质充血、水肿和间质内炎症细胞浸润情况。前列腺组织间质充血、水肿判断标准：无为“-”，轻度为“±”，较明显为“+”，显著为“++”；前列腺组织间质内炎症细胞浸润判断标准：0个细胞/HP为“-”，1～9个细胞/HP为“±”，10～19个细胞/HP 为“+”，≥20 个细胞/HP 为“++”。白细胞和卵磷脂小体计数：用天平称定前列腺湿重后取50 mg，将前列腺组织放入试管内，加人200µl 白细胞稀释液和200 µl 生理盐水中，充分混匀，取部分组织匀浆光镜下观察白细胞（WBC）和卵磷脂小体（DLCC）并计数。

2.4.3免疫组化检测 检测IL-8、TNF-α、IL-1β 和IL-4、IL-6、IL-10 在大鼠前列腺组织中的表达。前列腺组织用10%中性甲醛固定后，常规包埋切片。用显微镜对切片进行观察、拍照。高倍镜下观察切片标本，随机选取每个切片标本的10 个视野，应用图像分析系统（Image Pro Plus 6.0）测定每个视野阳性信号平均光密度值（OD），取均值，作为阳性染色的表达量。

2.5统计学分析 采用SPSS 26.0 软件进行统计分析。计量资料如符合正态分布，结果以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用One-Way ANOVA 或t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1泌尿清丸对大鼠体质量、前列腺的影响 见表1。各组大鼠体质量比较无显著性差异（P＜0.05）。与空白组比较，模型组前列腺湿重和前列腺指数明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和泌尿清丸低、中、高剂量组前列腺湿重和前列腺指数均显著降低（P＜0.05）；且泌尿清丸各剂量组随着给药剂量的增加，前列腺指数降低。

表1 泌尿清丸对大鼠体质量和前列腺的影响 （±s）

表1 泌尿清丸对大鼠体质量和前列腺的影响 （±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05，与模型组比较，②P＜0.05

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3.2泌尿清丸对大鼠前列腺组织的影响 各组大鼠前列腺组织HE 染色显示：空白组大鼠的前列腺组织未有异常变化；模型组大鼠前列腺腔内有分泌物，腺腔扩张增大，血管扩张充血，少见血管破裂，腺泡上皮细胞乳头状明显增生，间质明显纤维化且有大量淋巴细胞和浆细胞、中性粒细胞、巨噬细胞浸润；泌尿清丸低、中、高剂量组前列腺间质疏松水肿，血管周围有淋巴细胞浸润，导管扩张充血，间质内大量淋巴细胞和浆细胞浸润，腺泡上皮细胞乳头状增生明显，但与模型组比较间质内淋巴细胞明显减少，间质内可见散在的淋巴细胞，前列腺组织结构清楚，部分腺腔内有分泌物，腺体排列及分布基本正常，间质有极少量炎症细胞散在分布，炎症现象较模型组明显减轻；阳性对照组见腺腔增大，排列整齐，腔内有少量分泌物，腺上皮细胞轻度增生，间质有极少量炎症细胞散在分布。见图1。

图1 各组大鼠前列腺组织变化（HE×100）

3.3泌尿清丸对大鼠前列腺白细胞和卵磷脂小体的影响 见表2。与空白组比较，模型组前列腺组织液中的白细胞数目明显升高，卵磷脂小体密度明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和泌尿清丸低、中、高剂量组前列腺组织液中的白细胞数目均明显减少，卵磷脂小体密度均明显升高（P＜0.05）。

表2 泌尿清丸对大鼠前列腺白细胞和卵磷脂小体的影响 （±s）

表2 泌尿清丸对大鼠前列腺白细胞和卵磷脂小体的影响 （±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

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3.4泌尿清丸对大鼠前列腺组织中炎症因子和抗炎因子的影响 见表3。与空白组比较，模型组前列腺组织中各炎症因子和抗炎因子水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和泌尿清丸低、中、高剂量组均可明显降低前列腺组织中IL-8、TNF-α、IL-1β水平，明显升高IL-4、IL-6、IL-10水平（P＜0.05）。

表3 泌尿清丸对大鼠前列腺组织中炎症因子和抗炎因子的影响 （OD，±s）

表3 泌尿清丸对大鼠前列腺组织中炎症因子和抗炎因子的影响 （OD，±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

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4 讨 论

慢性非细菌性前列腺炎，属于中医学“淋证”“精浊”“白淫”“白浊”等范畴。古代医家对本病病机有较为深入的认识，如《诸病源候论》记载：“酒性有毒，而复大热，饮之过多，故毒热气渗溢经络，浸溢腑脏，而生诸病也。”《素问·痿证》记载：“思想无穷，所愿不得，意淫于外，入房太甚，宗筋弛纵，发为筋痿，乃为白淫。”《证治准绳·淋浊·遗精门》记载：“有人吸金石药者，入房太甚，败精流入胞中……则皆成淋。”古人认为其病因与饮酒贪色、吸食毒药等相关。《医学心悟·赤白浊》记载“浊之，有二种：一由肾虚败精流注，二由湿热渗入膀胱……”《寿世保元》记载：“精之主宰在心，精之藏制在肾，凡人酒色无度，思虑过情，心肾气虚，不能管摄，往往小便频数，便浊之所有生也。”指出其主要病机为肾虚，湿热流注下焦。

目前中医对慢性前列腺炎的治疗主要以辨证论治为主。如周安方采用“多法联治”分为三期辨证治疗：初期以湿热为主，肝郁为次，治法以清热利湿、疏肝理气为主；中期以血瘀气滞为主，湿热、肝郁、肾虚为次，治法以活血祛瘀、行气止痛为主，兼清热利湿、疏肝补肾；后期以肾虚为主，瘀血、湿热、肝郁次之，治法以补肾为主，兼活血化瘀、清热利湿、疏肝解郁［6］。

泌尿清丸为荆州市中医医院泌尿科院内协定处方制剂，具有清热利湿、活血通淋、行气止痛兼补肾气之功效。该方由桂枝、茯苓、泽兰、赤芍、桃仁、红花、金钱草、黄柏、石苇、猪殃殃、蒲公英、萆薢、菟丝子、三棱、莪术、王不留行、山茱萸、山药、川芎、白芍共二十味药物组成。方中金钱草、石苇清热祛湿，利尿通淋，共为君药。猪殃殃、蒲公英清热解毒利湿；茯苓健脾祛湿；萆薢除阳明之湿而固下焦，祛浊分清，利湿通淋；黄柏苦寒，清热燥湿，利尿通淋，主泻下焦隐伏之火，具有清下焦湿热、通淋之效；此五药共为臣药。金钱草、石苇、猪殃殃、蒲公英、茯苓、萆薢、黄柏，君臣共入下焦以清热利尿通淋。泽兰、桃仁、赤芍、红花同入肝经，均具有活血化瘀之功效，其中泽兰、红花祛瘀，桃仁化瘀，赤芍既可活血散瘀，又可清热，以散瘀久所化之热；四药合用共奏通经化瘀之功，寒热并用，无耗伤阴血之弊；桂枝辛甘而温，温通经脉，以行瘀滞；川芎辛温走窜，既能活血又能行气，称为血中之气药，具有通达气血之功；王不留行苦平，通利血脉，行而不驻，走而不守，既活血通经，又利水通淋，气行则血行，以行气化瘀而止痛；配合白芍缓急止痛。三棱苦平、莪术辛苦温，善破老血，通经利气，具有破血祛瘀、行气止痛之效，化瘀之力甚速而不伤正气。菟丝子、山药、山茱萸均入肾经，为补肾固肾之要药，菟丝子性温不燥，补而不滞，补阳益阴而固肾；山药滋养而不腻，养阴而固肾；山茱萸性温不燥，补而不峻，平补阴阳而固肾，三药合用，平补固肾，与清热祛湿、活血化瘀药相配，达到标本兼治、攻补兼施之效，共为佐药。全方配伍寒温并用，气血同调，攻补兼施，有祛邪不伤正、补益不留寇之特点。

本次研究表明，与模型组比较，泌尿清丸低、中、高剂量组前列腺湿重和指数均明显减少，同时可减少前列腺组织中的白细胞数目，增加卵磷脂小体密度，对大鼠前列腺炎组织炎性病变有明显改善。

研究表明，炎症因子和抗炎因子在慢性前列腺炎发病中起着重要作用。在组织的炎症反应过程中，炎症因子可促进炎症反应；抗炎因子可抑制炎症反应，促进组织修复和再生［7］。炎症在感染、损伤、毒素、免疫源等始动因素的作用下产生炎症因子，通过增加趋化因子和细胞黏附分子的表达，引起局部或全身炎症反应。抗炎因子可通过抑制炎症因子的活性，从而抑制炎症发展。因此，炎症因子与抗炎因子间的平衡将影响慢性非细菌性前列腺炎的发展过程及转归。

炎症因子IL-8、TNF-α、IL-1β 具有促进慢性前列腺炎的作用。IL-8 作为一种强效的炎症因子，主要由内皮细胞、成纤维细胞、单核-巨噬细胞及多种上皮细胞产生，具有诱导中性粒细胞、单核细胞向炎症部位聚集及调节白细胞黏附分子的表达，诱导白细胞趋向活性，促使局部组织发生炎症和损伤。对嗜碱性粒细胞和活化的T淋巴细胞亦有趋向活性，促进炎症反应。Hochreiter 等［8］研究表明，慢性前列腺炎、无症状型前列腺炎患者前列腺液中IL-8水平明显升高。Schaeffer等［9］研究发现，在慢性前列腺炎患者前列腺液、精浆中，IL-8 水平升高，且具有诊断和评价治疗效果的意义。TNF-α 由活化的单核-巨噬细胞产生，作用于内皮细胞，可增加黏附分子的表达，促进炎症细胞黏附、游走、浸润，巨噬细胞释放炎症因子，从而促进炎症反应。IL-1β 可诱导内皮细胞黏附分子表达增多，促使前列腺内皮细胞上的白细胞黏附增多，从而促进炎症反应。Alexander 等［10］研究发现，在慢性非细菌性前列腺炎患者的精浆中，TNF-α、IL-1β水平明显升高且呈正相关，具有临床诊断慢性前列腺炎意义。Nadler等［11］研究表明，在慢性非细菌性前列腺炎患者前列腺液中TNF-α、IL-1β水平明显升高。本研究表明，泌尿清丸低、中、高剂量组均能降低血清中IL-8、TNF-α 及IL-1β的水平。

抗炎因子IL-4、IL-6、IL-10 具有抑制慢性前列腺炎的作用。IL-4 由活化的T 细胞产生，可促进T、B 淋巴细胞的发育，驱动体液免疫反应。李树平等［12］认为测定血清中IL-4含量有助于CNP的分型诊断。同时，IL-6 可促进B 细胞分化产生抗体，促进T 细胞增殖和IL-2 的产生，是在炎症反应中具有重要作用的细胞因子。IL-6 还可抑制IL-1 和TNF-α 等炎症因子的合成，促进糖皮质激素和可溶性TNF 受体释放，抑制GS-CSF、INF-γ 等炎症因子的产生。Stancik 等［13］研究表明，慢性前列腺炎患者精液中IL-6 升高，药物干预后，IL-6 水平降低，是疗效评价的重要指标。IL-10由T细胞、活化的B细胞和单核吞噬细胞等产生，是已发现的重要的抗炎症因子。Miller 等［14］研究IL-2、IL-10、TNF-α 和IFN-γ 间的相互关系发现，在慢性前列腺炎患者的精浆中，IL-10、TNF-α和IL-2水平明显高于健康对照组，并且前细胞因子IL-8水平与抗炎细胞因子IL-8 水平呈负相关；研究还发现患者IL-10 水平越高，患者疼痛症状越严重。研究提示，IL-10 水平是评价慢性前列腺炎疗效的一个有效指标。王洪展等［15］用苯甲酸雌二醇成功诱导SD 大鼠慢性非细菌性前列腺炎动物模型，并检测了IL-10、TNF-α 和IFN-γ水平，发现慢性非细菌性前列腺炎组明显高于对照组，认为这些炎性因子参与了前列腺炎的发生、发展及转归，自身免疫异常可能是慢性非细菌性前列腺炎发病机制之一。本研究表明，泌尿清丸可升高慢性非细菌性前列腺炎大鼠组织中IL-4、IL-6、IL-10 的水平。

综上所述，泌尿清丸可改善慢性非细菌性前列腺炎，其作用机制可能是通过降低炎症因子水平、升高抗炎因子水平而发挥抗炎作用。