GQDs@Gel纳米体系的制备及其抑菌性能研究*

朱 韬，吴可馨，贺煜添，朱凤池，杨冬芝

(徐州医科大学新药研究与临床药学重点实验室，江苏 徐州 221004)

水凝胶(Hydrogel， Gel)由大量的水和相互交联的高分子组成，因其含水量(70%～99%)与生物组织接近而具有很高的生物相容性和高效载药能力[1]。智能水凝胶具有特殊环境(如温度、pH等)响应性质，成为药物载体的首选。Zhao等[2]利用制备的智能水凝胶同时包载阿霉素和紫杉醇两种药物，利用肿瘤环境的弱酸环境，药物释放表现出明显的肿瘤特异性。Kim等[3]制备利用水凝胶和微球的智能响应性，实现阿霉素和氟脲嘧啶在肿瘤部位的顺序释放。大部分水凝胶呈固态，在临床应用中收到限制。基于微环境设计的可降解水凝胶发展极为迅速[4-6]。

石墨烯量子点(Graphene Quantum Dots， GQDs)是一种零维碳纳米材料，优异的生物相容性和丰富的表面化学基团，使GQDs在生物医学领域[7]受到广泛关注。不同方法制备的GQDs具有明显不同的化学和物理性质。Ge等[8]以聚噻吩为原料合成的GQDs具有明显优于其他方法的性质，这种方法合成的GQD在一定激光照射下可释放单线态氧，具有很高的医学应用潜力。这一性质在我们在前期对GQDs抑菌性能研究中得以证实。但如何实现GQDs在疾病部位的定向释放是需要解决的问题。

本工作中我们选取具有酸度敏感性的水凝胶包载GQDs，比较Gel在不同酸度溶液中的降解性能及GQDs的释放行为，并研究了不同条件下GQDs@Gel的抑菌性能，结果发现，在弱酸条件下Gel发生降解从而释放GQDs，从而表现出良好的控制释放行为，为该复合材料在抑菌方面的应用提供了信息借鉴。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

葡聚糖70(W=70 kD)、壳聚糖(中粘度)和高碘酸钠(99.5%),上海麦克林生化科技有限公司;5， 10， 15，20-四(4-氨基苯基)卟啉、(三苯基膦)钯，上海阿拉丁生化科技有限公司。N，N-二甲基十二胺，3-噻吩硼酸和溴苄基溴，Alfa Aesar化学有限公司；大肠杆菌(ATCC：8739)和金黄色葡萄球菌(ATCC：29213)，北京中科质检生物技术有限公司；琼脂，微科曼德生物工程有限公司；酵母膏和胰蛋白胨，英国OXOID公司。

Q25扫描电子显微镜(SEM)，美国FEI有限责任公司；FL4600荧光分光光度计，日本岛津有限公司；UV-3100型可见紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；FD-1C-50真空冷冻干燥机，北京博艺康实验仪器有限公司；TG20高速离心机，海南凯达科学仪器有限公司；DF-1型集热式磁力加热搅拌器，江苏金坛市环宇科学仪器厂；Thermo Scientific超纯水仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 GQDs@Gel的制备与表征

GQDs的制备：参考本实验室合成方法制备GQDs[9-10]。 1 mmol 4-溴苄基溴和1.3 mmol N，N-二甲基十二胺溶于20 mL二氯甲烷/甲醇(V:V=3:2)，N2保护下室温搅拌12 h。将产物减压蒸馏浓缩至约5 mL，转移至无水乙醚，静置得白色沉淀，经过滤、真空干燥，得到白色晶体，即化合物1。取化合物0.96 mmol 1，1 mmol 3-噻吩硼酸，4.7 mmol无水碳酸钠和0.17 mmol 4-(三苯基膦)钯，溶解于30 mL乙醇/去离子水 (V:V=2:1)，N2保护下加热至90 ℃，反应6 h后产物经层析柱及薄层层析纯化得白色晶体化合物2。化合物2与FeCl3(质量比4:1)分别溶解于氯仿，将化合物2的溶液滴加入FeCl3溶液中，N2保护下室温反应48 h。经过滤、离心、甲醇洗涤3次，干燥可得暗红色固体，即为PT2。称取20 mg PT2，溶于40 mL去离子水，用NaOH调节pH至9～10后，溶液置于高压反应釜，160 ℃加热24 h。反应结束后冷却至室温，产物经过滤，滤液即为GQDs水溶液。

GQDs@Gel的制备：1 g高碘酸钠滴入葡聚糖的水溶液中，避光反应6 h，经透析、干燥即得醛基交联剂。0.02 g壳聚糖与0.05 g(5， 10， 15， 20)-四(4-氨基苯基)卟啉混和均匀，再加入GQDs量子点溶液(80 μg/ml)50 μL，醛基交联剂50 μL，经反应即得复合水凝胶GQDs@Gel。

1.3 细菌培养

细菌培养平板的制作：LB营养琼脂按照氯化钠1 g/ 100 mL、胰蛋白胨1 g/100 mL、酵母浸粉0.5 g/100 mL、琼脂1 g/100 mL溶解于去离子水中，在121 ℃、101 kPa条件下灭菌60 min后，稍冷却后倒入细菌培养皿中，每个培养皿约 20 mL，待其凝固后，置于4 ℃冰箱中无菌保存备用。

细菌复苏与培养：将冻存的菌种取出，于4 ℃冰箱内溶化。取5 μL菌种置于含有30 mL液体培养基的无菌试管内，于37 ℃，200 rpm恒温摇床中传代三次备用。将上述复苏的菌液离心后弃上清，然后用无菌去离子水将细菌混匀，使用UV-Vis在600 nm波长下测定OD值，当OD600为0.1时菌液的浓度为2×108CFU/mL。采用常规的37 ℃和200 rpm恒温摇床中培养。

1.4 GQDs@Gel的抑菌性能

GQDs@Gel的抑菌效果：通过考察GQDs@Gel对细菌的抑菌作用，评价GQDs在包载前后其抑菌效果。采用平板菌落计数法，以磷酸缓冲溶液(Phosphate Buffered Saline， PBS)为对照，选取剂量为4 μg GQDs@Gel溶液考察纳米材料的抑菌活性。每组分别设置3个平行对照。细菌存活率=实验组菌落数/对照组菌落数×100%。

GQDs@Gel的光动力抑菌效果：采用平板菌落计数法，分别考察GQDs@Gel在光照以及非光照条件下对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的抑菌效果。将实验分为光照组与非光照组，对于光照组使用白炽灯(功率5 W；距离40 cm)照射15 min后于37 ℃恒温培养箱内过夜培养，每组设置3个平行组。

2 结果与讨论

2.1 Gel的性质表征

SEM表征(图1)显示，Gel呈现三维网状结构，孔径约 10 μm。Gel在一定条件下会发生降解，生成原产物卟啉衍生物，卟啉衍生物在480 nm有特征吸收峰。实验考察了Gel在不同pH(5.0，6.5和7.4)下的状态，紫外-可见吸收光谱图及Gel的流动状态显示(图2)，在酸性条件下，卟啉衍生物的吸收强度明显提高，提示水凝胶的降解速度明显高于中性条件，这与水凝胶呈现出的凝胶状/流动状之间的变换一致。

图1 Gel的SEM表征图Fig.1 The SEM image of Gel

图2 Gel在不同pH环境下的降解Fig.2 The degradation of Gel in different medium

2.2 GQDs@Gel中GQDs的包载及释放

GQDs在650 nm(Ex=400 nm)处表现出荧光特征发射峰，比较GQDs及GQDs@Gel的荧光光谱图(图3)可知，GQDs@Gel在同样的位置表现出较强的荧光性能，证明Gel对GQDs的包载。

图3 The loading and release of GQDs in GelFig.3 Online and offline mixed experimental teaching mode

通过GQDs的紫外-可见吸收光谱性质计算在Gel中的包载，包封率为98.2%，包载量为90 μg/mg。实验同时考察了在pH=5.0、6.5、7.4的PBS介质中的GQDs的释放情况，结果显示GQDs@Gel在各溶液中孵育180 h时，GQDs的释放率明显不同。在pH=5.0的介质中GQDs释放率达到69.4%，而在pH 6.5和7.4中的释放率分别为42.9%和11.7%，呈现出明显的酸度敏感性，这与Gel的分解性能一致，说明GQDs的释放与Gel的酸度敏感性相关。这一性质为酸度敏感的药物治疗提供了可能性。

2.3 GQDs@Gel抑菌性能

文献显示，GQDs具有光动力抑菌性能[11-12]，实验研究了被Gel包在后GQDs@Gel在光照及非光照条件下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。结果如图4所示，以PBS为对照，在非光照条件下大肠杆菌的存活率分别为70.5%(pH 7.4)，12.0%(pH 6.5)和5.4%(pH 5.0)，金黄色葡萄球菌的存活率分别为76.7%(pH 7.4)，23.5%(pH 6.5)和15.2%(pH 5.0)，说明本实验制备的GQDs@Gel本身具有抑菌效果，且抑菌效果随溶液pH降低而增强，显示出明显的酸度响应性。同时，与非光照组比较，光照条件下明显增强了GQDs@Gel对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。数据显示分析，经GQDs@Gel处理后，光照条件下大肠杆菌的存活率为45.9%(pH 7.4)，2.7%(pH 6.5)和0.3%(pH 5.0)，金黄色葡萄球菌的存活率降低为60.2%(pH 7.4)，9.8%(pH 6.5)和2.6%(pH 5.0)。GQDs@Gel光照组与非光照组在抑菌性能上存在显著性差异(p<0.01)，GQDs被Gel包载后仍然表现出明显的抑菌性能，且光照可以显著增强其抑菌能力。

图4 不同pH条件下GQDs、GQDs@Gel抑菌效果图Fig.4 The antibacterial effect of GQDs and GQDs@Gel in different medium

3 结 论

本工作构建了酸度条件分解的水凝胶体系，并通过包载具有光动力性质的GQDs，形成具有酸度敏感性的GQDs@Gel复合抑菌体系。通过Gel和GQDs的光学性质，考察了材料的降解性及GQDs的包载和释放行为。不同酸度条件和光照条件下的抑菌实验证实，GQDs@Gel对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果，且呈现出明显的酸度敏感性，普通日光灯对于GQDs@Gel的抑菌效果具有明显的增强作用。本实验结果为抑菌药物的开发提供了有用的信息借鉴。