血清外泌体微小RNA-21 与微小RNA-124 水平变化在一氧化碳中毒并发迟发性脑病中的临床意义

景少巍 朱浩轩 杨晓燕 骆图南 欧阳晓春

（中国人民解放军联勤保障部队第九〇八医院，江西 南昌 330000）

一氧化碳（CO）中毒患者经治疗恢复后，可能再次发生大脑神经系统功能障碍，即迟发性脑病，该并发症危害性极大，会引起认知障碍、锥体系受损、大小便障碍等，增加死亡风险[1]。急性CO 中毒后，迟发性脑病发生率约10% ～30%[2]，经治疗后部分患者留有永久后遗症，预后较差。因此，临床一直在寻找有效指标以及时识别迟发性脑病的预后风险。近年来研究发现，外泌体与神经发育、生长以及修复过程密切相关，可以其为载体实现血液循环与中枢神经系统的物质双向传递[3]。外泌体中的微小核糖核酸（miRNA）也被证实与脑损害存在关联，如miRNA -21（miR-21）在脑组织缺氧状态下可见表达异常，miR-124 对中枢神经系统炎症以及免疫状态有调控作用[4-5]。为此，本研究中拟分析miR-21 与miR-124 在CO 中毒并迟发性脑病中的临床意义，为该病诊疗提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 解放军联勤保障部队第九〇八医院2020 年7 月—2021 年10 月收治的CO 中毒并迟发性脑病患者60 例作为病例组，CO 中毒至因迟发性脑病入院时间平均（5.15±1.04）d。病例纳入标准：①迟发性脑病就诊前1 周内存在CO 中毒史；②CO 中毒经治疗恢复后，再次出现意识障碍、定向障碍、反应迟钝等症状，符合CO 中毒并迟发性脑病诊断标准[6]；③年龄18 ～75 岁；④家属对研究知情同意，并签署知情同意书。排除标准：①既往有偏瘫、精神障碍病史；②合并急性或慢性感染、阿尔茨海默症、血管性痴呆等疾病；③合并有肿瘤疾病者；④合并心、肝、肾等脏器功能不全；⑤在CO 中毒前已出现脑损害；⑥患者或家属不愿意参与本研究，或中途退出者；⑦CO 中毒前有脑病相关治疗史者；⑧因其他脑部疾病接受治疗者。对照组35 例为同期体检的18 ～75 岁健康志愿者，均无脑部功能及重要脏器异常，也无脑病相关疾病治疗史，且均知情同意，签署知情同意书。两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05，见表1），具有可比性。本研究方案征得我院医学伦理委员会审核同意。

表1 两组患者一般资料比较

1.2治疗方法 所有患者根据病情给予改善微循环、纠正酸碱失衡等对症处理，定时帮助患者按摩四肢，指导翻身，维持肌张力。行高压氧治疗，每日1 次：进入高压氧疗舱（上海寰熙医疗器械有限公司，TB1800L-1.3TA 型），利用空气加压舱进行加压，时间为20 min，使舱内压调整为0.20 MPa，患者佩戴面罩，吸纯氧，时间为30 min，然后调整为吸舱内空气5 min，再次吸纯氧30 min，最后进行20 min 的减压，待减至常压后出舱；治疗10 d 为1 个疗程。给予患者地塞米松注射液10 mg/d 静脉滴注，连续5 d。同时患者接受康复训练，包括肌力训练、体位转移、四肢灵活度训练、平衡训练等，每次45 min，每周5 次。

1.3实验室检测指标与方法 病例组分别在确诊后第2 天（治疗前）、治疗6 个月后测定各指标，对照组在体检时检测。在受试者空腹状态下采集4 mL 肘静脉血，分装于两管。①其中一管离心5 min（2 500 r/min），分离血清，-80℃保存，采用酶联免疫吸附法测定血清缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、白细胞介素-6（IL-6）和IL-8 水平。②另一管离心10 min（3 000 r/min），去除细胞及其碎片，收集上清液，再次离心10 min（3 000 r/min），进一步清除残留血细胞，吸取上清液，-80 ℃保存备用，采用实时荧光定量逆转录- 聚合酶链反应法（RT-PCR）测定血清外泌体miR-21、miR-124 表达水平：经Trizol 试剂（上海联迈生物工程有限公司）提取外泌体内总RNA，操作按说明书进行，针对RNA 进行质检，取RNA 1 μL 测定纯度与浓度，其260 nm 和280 nm 处吸光度比值（A260/A280）为1.6 ～1.8 提示符合要求，剩余RNA -80 ℃保存备用；经血清miRNA 提取分离试剂（北京艾克赛仑生物科技有限公司）提取并收集外泌体内miRNA，-80 ℃保存备用；行逆转录，反应条件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，获得cDNA 产物；行荧光RT-PCR 扩增，PCR 程序：94 ℃ 5 min（预变性），95 ℃ 15 s（变性），60 ℃ 60 s 退火，72 ℃ 60 s（延伸），40 个循环。引物序列：①miR-21：上、下游引物序列分别为：5’-AC ACTCCAGCTGGCTAGCTTATCAGACTGA TG-3’、5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。②miR-124： 上、 下 游 引 物 序 列 分 别 为：5’-C G T G C A C A G C G G A C C T T G A T-3’、5’-C G G G A G C G G A C C T T A G T G G T-3’；③内 参 引 物U6： 上、 下 游 序 列 分 别 为5’-C T C G C T T T G C A A C T T A G-3’、5’-CGCCACGAAGAATGAATGTC-3’。 通 过2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

1.4昏迷程度与预后评估 ①在治疗前进行格拉斯哥昏迷评分（GCS）评估昏迷程度[7]：共计15分，13 ～15 分、7 ～12 分、＜7 分分别代表轻、中、重度昏迷。据此将患者分为轻中度昏迷组（n=43例）和重度昏迷组（n=17 例）。②在治疗6 个月后进行格拉斯哥预后评分（GOS）[8]评价预后：①死亡；②植物状态：反应性降低，有觉醒特征，可有吸吮、睁眼等反应；③重度残疾：意识清醒，但24 h 均需他人照料；④轻微残疾：在保护下能够独立生活，对他人依赖性小；⑤恢复良好：社交、工作正常，可有轻微后遗症。其中①、②、③为预后不良，④、⑤为预后良好。据此将患者分成预后不良组（n=15）、预后良好组（n=45）。

1.5统计学方法 利用SPSS20.0 软件分析数据资料，计数资料用例数和百分比（%）表示，行χ2检验。计量资料（符合正态分布）以表示，行独立或配对样本t检验。两个变量之间的相关性行Pearson 线性相关分析，经多元Logistic 回归模型分析患者预后独立影响因素。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析本次构建的多元Logistic 回归模型评估预后的价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1病例组和对照组血清外泌体miR-21、miR-124 表达比较 病例组治疗前的血清外泌体miR-21、miR-124 表达低于对照组（P＜0.001），治疗后其表达高于治疗前（P＜0.05），但仍低于对照组（P＜0.001）。见表2。

表2 两组患者血清外泌体miR-21、miR-124 表达及血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的比较

表2 两组患者血清外泌体miR-21、miR-124 表达及血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的比较

注：与对照组比较：*P ＜0.001；与本组治疗前比较：#P ＜0.05。

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2.2病例组和对照组血清HIF-1α、IL-6、IL-8水平的比较 病例组治疗前的血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平高于对照组（P＜0.001），经治疗后，患者各指标水平均低于治疗前（P＜0.05），但仍高于对照组（P＜0.001）。见表2。

2.3预后良好组和预后不良组miR-21、miR-124和血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的比较 治疗前，两组各指标水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，预后良好组血清外泌体miR-21和miR-124 表达高于治疗前与预后不良组，血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平低于治疗前与预后不良组（P＜0.05）。见表3。

表3 预后良好组和预后不良组miR-21、miR-124 和血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的比较

表3 预后良好组和预后不良组miR-21、miR-124 和血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的比较

注：与预后不良组治疗6 个月比较：*P ＜0.05。

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2.4病例组miR-21、miR-124 表达与HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的相关性 Pearson 线性相关分析提示，血清外泌体miR-21 和miR-124 表达与HIF-1α、IL-6、IL-8 水平呈负相关（P＜0.01）。见表4。

表4 病例组miR-21、miR-124 表达与血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平的相关性分析

2.5不同昏迷程度患者的miR-21 和miR-124 表达比较 治疗前，不同昏迷程度患者miR-21 和miR-124 表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，两组各指标表达均高于治疗前（P＜0.05），且轻中度昏迷组高于重度昏迷组（P＜0.001）。见表5。

表5 不同昏迷程度患者miR-21 和miR-124 表达的比较

表5 不同昏迷程度患者miR-21 和miR-124 表达的比较

注：与本组治疗前比较：#P ＜0.05。

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2.6中毒后不同时间接受高压氧治疗患者的miR-21、miR-124 表达比较 在60 例患者中，有46 例在中毒12 h 内行高压氧治疗，14 例中毒12 h 后治疗。据此分组，治疗前，两组miR-21 和miR-124表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗后，两组各指标表达高于治疗前（P＜0.05），且中毒12 h 内治疗组各指标表达高于中毒12 h 后治疗组（P＜0.001）。见表6。

表6 中毒后不同时间接受高压氧治疗患者的miR-21、miR-124 表达比较

表6 中毒后不同时间接受高压氧治疗患者的miR-21、miR-124 表达比较

注：与本组治疗前比较：#P ＜0.05。

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2.7患者预后分析 通过多元Logistic 回归模型分析提示，miR-21 和miR-124 表达增高及早期行高压氧疗是预后保护因素，而HIF-1α、IL-6、IL-8 水平增高及昏迷程度加重是预后危险因素（P＜0.01）。见表7。基于多元Logistic 回归模型评估患者预后的ROC 曲线见图1，曲线下面积为0.876（标准误：0.055，P＜0.001，95%CI：0.768 ～0.985）。

图1 CO 中毒并发迟发性脑病预后的多元Logistic 回归模型评估患者预后的ROC 曲线

表7 患者预后危险因素的多元Logistic 回归模型分析

3 讨 论

迟发性脑病是CO 中毒后的一种严重并发症，发病机制复杂，可能与细胞凋亡、细胞毒性损伤、缺氧缺血等机制相关[9]。近年来研究发现，miRNA 在机体多个器官内存在丰富表达，并且对多种蛋白编码基因表达有影响，其参与了缺氧、缺血状态下的细胞扩增、凋亡、代谢、分化、迁移、神经元发育等过程，与脑部神经功能损伤性疾病密切相关[10]。在脑内组织缺氧、缺血状态下，神经元、小胶质细胞等会分泌大量外泌体，外泌体转运miRNA 参与神经细胞修复、抗凋亡机制[11]。因此，通过寻求与脑内神经损害相关的血清外泌体miRNA，可能为迟发性脑病的诊疗提供帮助。

本次研究结果提示，与对照组相比，病例组的血清外泌体miR-21 和miR-124 表达下降，经治疗后二者表达有所升高，但仍低于对照组，提示miR-21 和miR-124 表达下降与迟发性脑病有关，二者表达越高，对患者病情越有利。研究发现，缺血缺氧性脑病患儿miR-21 表达高于正常新生儿[12]。另有研究指出脑出血患者外周血miR-21 表达下调[13]。这表明临床对于miR-21 在脑损伤中的作用还存在争议，需进一步探讨。动物实验发现，miR-21 对缺血缺氧状态下的神经细胞有保护作用，其高表达对N2a 细胞内p53 表达有抑制作用，这可能是miR-21 保护神经功能的机制[14]，为本次结论提供了支持。miR-124 对神经元发育有促进作用，且参与受损神经元功能的修复过程，对脑组织受损后的神经元炎症有抑制作用，它可能利用对丝裂素活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶通路进行调节，抑制神经细胞凋亡，对其予以保护。

本研究中，与对照组相比，病例组治疗前后的血清HIF-1α、IL-6、IL-8 水平均较高。在严重缺氧的情况下，HIF-1α 过表达能够对血管内皮生长因子以及促红细胞生成素表达进行诱导，增强血管通透性，致炎症反应加重。李晟等[15]研究发现，CO 中毒患者中枢神经损伤的发生与HIF-1α 基因多态性有关。IL-6 和IL-8 是常见的炎症因子，在机体处于炎症状态时水平增高，能促进炎症进展，与缺血缺氧所致的炎症反应存在密切关联[16-17]。本研究结果显示，CO 中毒并迟发性脑病预后良好者经治疗后，血清外泌体miR-21 和miR-124 表达较预后不良者增高，而HIF-1α、IL-6、IL-8 水平下降，提示miR-21 和miR-124表达上调以及炎症缓解有利于改善预后。miR-21 能对磷酸酶张力蛋白同源物基因- 蛋白激酶B信号通路予以调控，从而对神经元细胞凋亡进行抑制[18]。miR-124 则能通过促进脑损伤组织内小胶质细胞的转化（M1 型转化成M2 型），缓解神经炎症[19]。而HIF-1α、IL-6、IL-8 与miR-21、miR-124 作用相反，其具有促炎作用，能加重神经炎症。故经治疗后，预后良好者miR-21 和miR-124 表达更高，而促炎相关指标下调。本研究中还发现，CO 中毒迟发性脑病患者miR-21 和miR-124 表达与HIF-1α、IL-6、IL-8 之间存在相关性，且miR-21 和miR-124 对预后有保护作用，而HIF-1α、IL-6、IL-8 是预后危险因素，这可能主要与miR-21 和miR-124 的神经炎症抑制作用以及HIF-1α、IL-6、IL-8 促炎作用有关，各指标因对炎症的影响不同而产生负性相关，并影响预后。通过进一步分析提示，不同昏迷程度、不同高压氧疗开始时间的患者在血清外泌体miR-21和miR-124 表达上也存在差异，且昏迷程度与高压氧疗开始时间均与预后有关。昏迷越重以及CO中毒时间越长的患者可能伴随的神经炎症越重，从而导致患者miR-21 和miR-124 表达出现差异。随着昏迷程度越重，患者的预后不良风险必然越高，早期给予高压氧疗能够及时缓解病情，降低预后不良风险。

综上所述，CO 中毒迟发性脑病患者血清外泌体miR-21 和miR-124 表达明显下降，二者表达增加有利于预后。本研究局限性在于病例样本数和观察时间均有限，未来需扩增样本、延长观察时间分析miR-21、miR-124 与患者远期预后的关系。