流式细胞术监测免疫抑制后树鼩外周血淋巴细胞的动态变化*

江 惠，赖永静，李 骅，冯一唯，夏 巍，唐安洲

（广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科 广西医科大学区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室，南宁 530021）

树鼩是一种小型哺乳动物，隶属攀鼩目，主要分布于马来西亚、菲律宾，我国云南、广西等地区[1]。树鼩与灵长类亲缘关系较近[2]，并且具有繁殖周期短、饲养成本低的特点，因此被用于人类疾病的预防和治疗研究，国内外学者已建立多种疾病树鼩模型[3-11]。然而，相比大鼠、小鼠等成熟的模型动物，目前树鼩特异性抗体等实验试剂的开发尚不充分，影响对诸如树鼩免疫系统特性等方面的研究。流式细胞术是一种通过流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征，并根据这些特征精确分选细胞的技术，通过加入特异性抗体可将细胞群进一步细分，如将外周血淋巴细胞分为CD3、CD4、CD8等，可用于免疫学[12-14]、细胞和分子生物学等方面研究[15]。建立和开发树鼩特异性抗体是一项投入较大的基础工程，需要进行系统研究，逐步开发完善。近年有学者通过筛选其他物种来源（小鼠、兔等）的荧光抗体，根据抗原抗体交叉反应的特性，进行树鼩细胞表型分析，结果表明小鼠的相应抗体具有相对特异性和敏感性[16-18]。使用跨物种抗体具有价格低、获取方便等优势，可为建立树鼩淋巴细胞分析和数量变化方法提供快捷路径。

环孢素A（cyclosporine A，CsA）是由真菌代谢产物中提取得到的由11个氨基酸组成的环状多肽，可选择性抑制T细胞活化[19]，对B细胞的抑制作用弱，可部分抑制T细胞依赖的B细胞反应，常用于抑制淋巴细胞。本研究主要应用流式细胞术，探索建立一种适用于树鼩外周血淋巴细胞的检测方法，并且利用该方法动态观察注射CsA树鼩的淋巴细胞、CD4+、CD19+细胞百分比的变化，为树鼩动物模型的建立及人类免疫缺陷相关疾病的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年树鼩18只，体重110～160 g，购自昆明医科大学实验动物中心，为人工繁育的普通级中缅树鼩滇西亚种，饲养于广西医科大学实验动物中心，采用金属笼具单笼饲养，内置休息木盒，室温22～25℃，湿度40%～60%，每日光照12～14 h，保持笼具、食具清洁卫生，定时喂食谷物、面包虫、水果等，自由饮水，室内保持安静。实验过程中树鼩的饲养和实验操作均符合广西医科大学动物实验伦理委员会相关规定。

1.2 主要试剂及仪器 PBS（Solarbio，北京）、FITC仓鼠抗小鼠CD3（BD，美国）、APC大鼠抗小鼠CD4（BD，美国）、APC抗鼠CD19（Biolegend，美国）、牛血清白蛋白（BSA，BioFroxx，德国）、红细胞裂解液（Solarbio，北京）、台盼蓝染色液（Sigma、美国）。流式细胞仪（BD FACSVerse，美国）、台式高速低温离心机（Eppendorf 5810R，德国）、光学显微镜（Olympus，日本）。

1.3 实验分组及处理 将18只树鼩随机分为空白组（10只）、CsA高剂量组（4只）和CsA低剂量组（4只）。空白组不予处理。CsA高、低剂量组分别经腹腔注射20 mg/kg和40 mg/kg的CsA，连续注射35 d，1次/d。采血当日不注射。

1.4 血样采集 分别在第1、第7天，抽取空白组股静脉血1 mL（比较不同时间淋巴细胞及各亚群差异，以检验流式实验操作的稳定性）。分别在第0（注射CsA前1 d）、第7、第13、第20、第29、第35天，抽取CsA高、低剂量组股静脉血1 mL。采血前12 h禁食，将动物固定于保定装置，采血后迅速放入含有EDTA抗凝剂的采血管中，轻轻摇晃混匀，室温放置。

1.5 树鼩外周血单细胞悬液的制备 采集的血液加入3倍体积红细胞裂解液，冰上裂解15 min；4℃离心10 min（2 000 r/min），弃上清液，加入2倍体积裂解液，吹打混匀，动作轻柔，再次4℃离心10 min（2 000 r/min）；小心吸弃上清液，用染色缓冲液重悬，即得外周血单细胞悬液，将细胞密度调整为1×106个/mL，置于冰上避光备用。

1.6 台盼蓝染色法检测两种不同染色缓冲液对细胞存活率的影响 取空白组外周血单细胞悬液10μL（之前分别用两种不同染色缓冲液：1×PBS溶液、含1%BSA的1×PBS溶液重悬），加入10μL台盼蓝进行染色，显微镜下观察、拍照，计算细胞存活率。细胞存活率=活细胞数量/总细胞数量。死细胞被染成蓝色。

1.7 流式细胞术检测树鼩外周血淋巴细胞表面分子 将树鼩外周血单细胞悬液分装到无菌无酶的洁净1.5 mL EP管中，每管100μL；避光加入1μL流式荧光抗体，轻轻摇晃混匀，4℃避光孵育30 min；加入1 mL染色缓冲液，轻轻摇晃混匀；1 300 r/min离心5 min，小心吸弃上清液；加入200μL染色缓冲液重悬，流式细胞仪检测树鼩外周血淋巴细胞及其亚群（CD3+、CD4+、CD19+）。将CsA高、低剂量组的第0天结果（淋巴细胞及亚群百分率）均设为100%，计算第7、第13、第20、第29、第35天结果与第0天结果的比值。

1.8 统计学方法 使用flowjo（10.6.2）软件分析流式数据。采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 树鼩外周血模型 SSC为侧向散射光，表示细胞内容物的复杂度，FSC为前向散射光，表示细胞体积的大小。树鼩外周血与灵长类动物结果相似，显示树鼩外周血可清晰地分为4群，分别为细胞体积较大、胞内容物较丰富的粒细胞（a），中等大小的髓样细胞（b），体积较小的淋巴细胞（c）以及小颗粒（红细胞、血小板和碎片，d），见图1。

图1 树鼩外周血FSC/SSC模式图

2.2 不同染色缓冲液对细胞存活率的影响 用含1%BSA的PBS作为染色缓冲液重悬的细胞存活率高于用PBS重悬的细胞（P＜0.05），见图2。

图2 不同染色缓冲液对细胞活率的影响

2.3 空白组不同采血时间的外周血淋巴细胞及其亚群百分率比较 空白组不同采血时间的外周血淋巴细胞、CD3+、CD4+、CD19+百分率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。CD3+细胞百分率的检测结果标准差过大，因此该实验结果不可信，见图3。

图3 空白组不同采血时间的外周血淋巴细胞及其亚群百分率比较

2.4 动态监测注射CsA树鼩淋巴细胞及亚群百分率变化 由于前述结果显示实验中所使用的CD3抗体并不适用于检测树鼩CD3+细胞，故仅对注射低剂量和高剂量CsA树鼩的淋巴细胞、CD4+、CD19+细胞进行动态观察（35 d）。

CsA高、低剂量组淋巴细胞在注射前两周下降，在第3、第4周有所上升，第5周下降；两组CD4+细胞在第1周有轻微上升趋势，第2周明显下降，之后呈先升高再下降的趋势；CsA低剂量组CD19+细胞在前3周先下降后上升，随后持续下降，而高剂量组在整个观察期内呈持续下降趋势，见图4。

图4 注射CsA后树鼩外周血淋巴细胞、CD4+和CD19+细胞百分率的变化

3 讨论

本研究建立了一种应用流式细胞术检测树鼩的外周血淋巴细胞的方法，FSC/SSC模式图显示所制备的树鼩外周血淋巴细胞样本分群良好、细胞碎片少。在PBS中加入1%BSA后，提高了裂解后的细胞存活率，细胞状态对于流式分析上机的结果影响较大，存活率高的单细胞悬液能够尽可能地排除实验的误差，得到更准确、可靠的实验数据，同时也为流式细胞分选实验打下了基础，状态良好的细胞有利于分选实验后的细胞培养与功能检测相关实验。

使用相同的红细胞裂解以及样本染色实验流程分别在第1天和第7天检测空白组树鼩外周血淋巴细胞、CD3+细胞、CD4+细胞和CD9+细胞的百分比，以探究实验操作的稳定性，同时评估跨物种流式抗体应用于树鼩外周血淋巴细胞样本的可行性，实验结果表明不同时间淋巴细胞、CD4+细胞、CD19+细胞百分率均无明显差异，可认为本实验建立的流式细胞实验方法稳定、可靠。由于CD3为T细胞广谱的表面分子，本实验中使用的CD3抗体与细胞表面结合后检测得出的百分比相对较低，并且标准差较大，说明抗体与细胞结合不够稳定，即该抗体不适用于检测树鼩外周血CD3+细胞免疫表型。因此，对于已经筛选出的跨物种抗体，如要用于树鼩研究，应进一步验证实验稳定性。

此外，本研究结果显示，注射CsA树鼩的淋巴细胞、CD4+、CD19+细胞总体呈下降趋势，与CsA药理学作用相符，证明CsA对树鼩有免疫抑制效果，可用于制备免疫抑制状态的树鼩模型。目前已有树鼩免疫细胞表面分子相关研究，并且学者们也相继进行树鼩特异性抗体制备的探索[20-24]，相信未来针对树鼩的研究工具，包括其专用的试剂、适合树鼩的实验方法等将逐渐完善。然而，目前难以通过流式细胞学方法精确分析树鼩免疫细胞表型，今后将进一步探索树鼩模型，制备树鼩特异性抗体，更好地利用流式细胞术分析树鼩免疫系统特性，完善树鼩作为免疫相关疾病动物模型的建立。

综上，本研究在缺乏树鼩特异性抗体的情况下，建立了适用于树鼩外周血样本检测的流式细胞学方法，利用抗体的交叉反应性筛选了适合用于分析树鼩外周血CD4+和CD19+细胞的抗体，观察到树鼩在免疫抑制状态下外周血淋巴细胞、CD4+以及CD19+细胞的变化趋势，为进一步研究树鼩的T、B淋巴细胞对感染的反应以及其对疾病发生、发展的作用打下基础。