湿地松不定根诱导中内源激素水平变化*

王会周 陈志东 石礼盛 黄淑敏

( 1. 深圳市宝安区罗田林场, 广东 深圳 518100; 2. 福建农林大学 林学院, 福建 福州 350002 )

湿地松Pinus elliottii生长性状优良，基于脂材两用的开发应用价值，目前已成为我国南方主要造林树种[1]。速生、高抗、优质多功能目标林木育种是实现林业可持续经营的根本与保障。然而当前湿地松速生高抗种子园产量较低，育种周期又长，远远不能满足当前种苗良种化大规模发展的需要[2]。因此，生产上建立一种高效的繁殖湿地松优良种质的技术体系尤为迫切。

无性繁殖是能保持亲体优良性状的一种繁殖技术[3]。扦插作为无性繁殖技术中最简单易行的一种手段，被广泛应用于林业科研和生产。以往研究发现，湿地松扦插具有明显的生理年龄效应，母株年龄为1～3 年时，扦插生根可达90%以上，而母株年龄为6 年时，扦插生根率不足30%[2]。季孔庶等[4]也发现，4 年生以上马尾松Pinus massoniana母株插穗生根能力显著下降。杨峰等[5]认为，年龄效应是进行松树嫁接、扦插、组织培养等无性繁殖时的共同难题，不定根诱导是组培、扦插无性育苗中的关键技术环节，年龄效应直接影响不定根发生。为加快湿地松优良种质材料的推广应用，进一步提升湿地松无性育苗中的生根稳定性极为重要。激素在植物不定根形成中起到至关重要的作用[6-7]。因此，本试验以4 年生湿地松母株上所采穗条为试验材料，通过扦插育苗的方法，分析不定根诱导过程中插穗根茎解剖构造与内源激素水平变化，以期揭示内源激素对湿地松生根的影响，为湿地松生根能力优化与提升提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以优良的湿地松种子培育实生苗为采穗母株，通过截顶促萌修剪方式进行母株管护，采集4 年生母株在当年3 月份生产的5～8 cm 长、生长健壮、未木质化穗条为试验材料，通过扦插方式开展不定根诱导试验。

1.2 试验方法

1.2.1 不定根诱导 采用容器扦插育苗的方法，以黄泥为育苗基质，参照前人最优[8]的湿地松扦插育苗生根处理方式（扦插成活率97.5%），以1 000 mg/L IAA 浸泡插穗基部5 min 后插入经高锰酸钾消毒的黄泥杯（Ф=4 cm，高=7 cm）。不定根诱导试验在控制环境条件的光照培养箱中进行，温度25±1℃，光照强度2 000 lx，每日光照16 h，相对湿度85%。试验重复5 次，每重复60 株。

1.2.2 不定根解剖构造观察 显微镜观测：在扦插生根处理中每隔5 天取出穗条，经流水冲洗干净后，切下约5～8 mm 长度大小的根茎基部，转入FAA 固定液进行，依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100% 酒精系列脱水，然后进行透蜡和包埋。最后用转动切片机切片，进行番红固绿对染后用阿拉伯中性树胶封片，观察不定根发生并显微拍照。重复3 次取样进行观察拍照。

油镜观测：为进一步清晰观测湿地松生根过程中根茎细胞变化，参考吴均章和韩素芬方法[9]，利用油镜进行显微观测。取样时间与方法同上，然后将根茎样品转入FAA 液固定，再依次用50%、70%、80%、95%、100%酒精脱水。脱水后将根茎置入Technovit7100 活化液中渗透，然后采用电镜超薄切片用的定向包埋板, 于40 ℃温箱中使之快速固化，最后用旋转切片机切片，利用Gimsa 染色后在1%偏重亚硫酸钠溶液中漂洗，将切片自然晾干后放入二甲苯透明，中性树胶封藏。重复3 次取样在油镜下进行观察拍照。

1.2.3 内源激素水平测定 根据生根解剖构造显微观察结果，于生根诱导处理第0（初期，R0）、20（根原基形成期，R20）、45 天（不定根形成期，R45）取样测定内源激素水平的变化。使用仪器：美国安捷伦公司生产的Agilent 1290 液相色谱仪、Agilent 6460C 三重四极杆质谱仪和配电喷雾离子源，测定内源激素包括吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GAs）、脱落酸（ABA）和玉米素核苷（ZR），激素标准品为Sigma 公司生产，色谱纯级。色谱条件和质谱条件参照王荣[10]的方法，取不同生根时间处理R0、R20、R45 插穗基部1 cm 长的根茎为测试样品，各重约2 g，于液氮中研磨成粉末，分离上清液，过聚乙烯聚吡咯烷酮PVPP 柱和二乙基氨基乙基交联葡聚糖凝胶（DEAESephadex A-25）柱净化，过0. 22 μm 滤膜后检测。重复3次取样进行测定。

1.2.4 外源生长调节剂促根处理 根据解剖构造与内源激素水平分析结果，生根处理20 天后，采用4 个不同浓度多效唑（PBZ）水溶液喷施插穗针叶。其中，以0 mg/L PBZ（纯水）为对照，设置25、50、100 mg/L 3 个PBZ 处理。喷施插穗针叶时，每株喷施5 mL，每隔10 天喷施一次，连续喷施3 次。于生根处理45 天，取出插穗观察湿地松生根能力变化。统计不同PBZ 处理插穗生根率和长度≥5 mm 的不定根数目。其中，生根率（%）=（生根苗株数÷扦插穗条总数）×100，根条数=生根穗条不定根数目总和÷生根苗株数。每处理5 重复，每重复扦插60 株。生根培养温度、光照、湿度条件同1.2.1。

1.3 数据处理

利用单因素方差分析（one-way ANOVA，α=0. 05）对不同PBZ 处理间的均值进行差异显著性分析。数据采用SPSS 19.0 统计分析软件进行方差分析及Duncan’s 多重比较（α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 不定根发生过程分析

以湿地松4 年生母株上扦插穗条为初始材料（图1A）进行不定根诱导，通过每隔5 天取样动态观察发现，湿地松生根处理20 天时，茎切口愈合（图1B），45 天时形成不定根（图1C）。同时，生根处理45 天后观察到大量茎基部愈伤化程度严重的无根苗（图1D）。通过显微结构观测证明，湿地松无潜伏根原基（图1E），生根处理20天，在维管形成层诱导产生根原始体细胞（图1F，黄色箭头所示），在生根处理45 天时发育形成不定根（图1G）。而生根处理45 天的无根苗中也发现了根原始体细胞团（黄色箭头所示），但其周围薄壁细胞中出现大量染色为红色的栓化或脂质化物质（图1H）。为进一步确证根茎细胞发育过程，在高倍高清油镜显微观测下，根原始体细胞（红色箭头所示的具有增大细胞核的细胞）在生根处理20 天产生（图1J），而生根处理45 天在有根与无根苗中均诱导出了根原始体，但在无根苗的根茎细胞中发现大量脂性物质（绿色箭头所示，图1K～1L）。上述结果表明，扦插生根处理20 和45天，可分别作为湿地松扦插苗根原基发生与不定根形成两个关键时期。同时，根茎细胞中代谢物质积累与湿地松不定根发育和形成密切相关。

2.2 内源激素水平变化

内源激素与不定根形成及植物代谢物质积累紧密关联。根据生长素（IAA）、细胞分裂素（ZR）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GAs）四大类内源性激素在湿地松不定根形成中检测结果发现，IAA、ABA、GAs 水平随生根过程不同而变化，而ZR 水平变化不大。其中，IAA 先下降后上升、GAs 与之相反呈先上升后下降趋势，ABA 则随生根时间延长而增加。说明，IAA、ABA、GAs 显著影响着湿地松不定根产生。根据生根处理45 天有根与无根苗中内源性激素水平的差异分析结果来看，IAA、ABA、ZR 无显著差异，而无根苗中GAs 水平显著高于有根苗。这暗示了，高浓度的内源GAs 与湿地松不定根形成困难密切相关。

2.3 PBZ 促根性分析

图2 湿地松不定根生根过程中内源激素水平变化Fig.2 Endogenous hormone levels during adventitious rooting in Pinus elliottii

从有根与无根中内源性激素水平的分析来看，GAs 显著影响湿地松不定根的形成。以GAs 生物合成抑制剂多效唑（PBZ）为促根剂在扦插20 天后喷施插穗针叶，分析PBZ 对湿地松不定根发育的促进性。由图3 可知，相较未施用PBZ 对照处理（0 mg/L PBZ），施用50 mg/L PBZ 能明显改善插穗生根率与根系质量，生根率和根系条数分别增加了63.0%和90.6%，但过高浓度PBZ（100 mg/L）较对照降低了20.5%和62.5%。说明，PBZ 能提升湿地松插穗生根能力，具有较强的促根性，但其使用浓度应控制在一个适度范围。

图3 PBZ 对湿地松不定根发育的促根性Fig.3 Promotive effects of PBZ on adventitious root development in Pinus elliottii

3 结论与讨论

生根解剖构造观察结果证明，湿地松无潜伏根原基，不定根通过由诱导根原始体发育形成。无潜伏根原基是植物生根困难的关键原因[11]。研究发现，植物不定根大多源于维管形成层[12-13]，在维管形成层中可直接诱导产生不定根原始体[14-16]。从植物细胞功能来看，维管形成层细胞分裂分化能力强，易被诱导、分化[17]。从本试验研究结果来看，湿地松不定根诱导处理20 天，在维管形成层诱导产生了具有明显增大细胞核的不定根原始体。之后，在生根处理45 天时随着不定根原基细胞进一步分裂分化而发育成为不定根。与马尾松P. massoniana、核桃Juglans regia、毛白杨Populus tomentosa等难生根木本植物相比，湿地松不定根发生部位相似[12-13,18]。在湿地松有根与无根苗中，均发现了大量诱导产生的根原基细胞团，但无根苗皮层及韧皮薄壁细胞中积累了大量脂性物质，从而可能形成了一种机械性障碍，阻碍了根原基细胞团进一步发育成为不定根。这说明，今后湿地松不定根再生要从不定根发生（根原基诱导）与形成（根原基发育）两个阶段进行考虑，尤其后者将直接影响着根系再生效果。

从本试验湿地松插穗生根过程中IAA、ABA、ZR 和GAs 4 种内源激素水平的变化来看，IAA、ABA 和GAs 与湿地松不定根诱导密切相关，其中GAs 影响根原基发育。作为植物生长发育的重要调节因子，激素在不定根诱导中起到关键性作用[6-7]。通过分析IAA、ABA 和GAs 水平在湿地松不同生根时期的变化，能较好地反映内源激素在湿地松不定根再生中的作用。对IAA 而言，先下降后上升变化模式说明低水平IAA 利于根原基诱导，而高水平IAA 能促进不定根发育与形成；ABA 直线上升趋势说明高水平的ABA 利于湿地松不定根的再生；GAs 先上升后下降，说明GAs 在湿地松不定根再生中早期能促进不定根原基产生，但后期不利于不定根形成，在湿地松生根中存在双重作用，而生根处理45 天无根苗中高水平的GAs 也揭示了GAs 对湿地松不定根发育的潜在抑制性。为观察GAs 在湿地松不定根发育中的作用，本试验采用一种被广泛使用的GAs 生物合成抑制剂多效唑（PBZ）[19-20]作为促根剂，在诱导出根原基后通过喷施针叶促根发育。根据试验结果，在50 mg/L PBZ 作用下湿地松4 年生母株插穗生根率和根条数均显著增加，说明GAs 在湿地松不定根发育中具有抑制性，外源性PBZ 能提升湿地松生根能力。

综上所述，建议湿地松不定根诱导可采用两步法，早期（扦插0～20 天）生根培养中可使用由生长素、赤霉素和脱落酸组成的一种复合型外源生长调节剂，后期（扦插21～45 天）培养中则使用多效唑。根据以往文献报道，松树生根能力有着显著的遗传基础与生理年龄效应[4-5,21]，因此添加的生长调节剂浓度应根据材料来源（种源、家系、无性系）与材料类型（幼龄、成熟龄）进行相应调整。