不同溶剂亚临界萃取樟树叶精油化学成分分析及抑菌效果*

胡 珊 黄 皓 陈杰连 梁卫驱连辉明 侯 晨 罗华建 谢佩吾

(1.东莞市农业科学研究中心,广东 东莞 523086；2. 广东省林业科学研究院 / 广东省森林培育与保护利用重点实验室,广东广州 510520)

樟树Cinnamomum camphora，又名香樟、乌樟、樟木、芳樟等，为樟科樟属常绿阔叶乔木，原产于我国东南以及西南各地，广西、广东、江西、福建、台湾、湖南、湖北、四川、云南等地均有分布[1]。樟树皮、根、茎、叶均可提取精油，该精油具有抑菌、止痛、抗癌、抗氧化等作用，是香料香精、医药卫生等行业的重要原料[2-5]。

樟树精油的提取方法有水蒸气蒸馏法、有机溶剂提取法、超临界二氧化碳萃取法、超声波辅助提取法、同时蒸馏萃取法、微波辅助水蒸馏法等[6]。但亚临界萃取樟树精油的研究甚少。周海旭等[7-8]研究表明以丁烷为溶剂，提取温度为65 ℃、解析温度45 ℃、提取时间40 min 为樟树精油亚临界萃取的最优工艺条件，得率为3.54%，该精油对大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、枯草杆菌Bacillus subtilis均有不同程度的抑制作用。

溶剂种类是影响提取效果的重要因素。根据相似相溶原理，溶剂种类会影响提取物中化学成分的组成，进而影响其应用效果。因此，通过比较不同提取溶剂所得提取物化学成分和应用效果，能够筛选出合适的提取溶剂种类[9]。目前，不同溶剂亚临界萃取樟树叶精油未有研究。本研究选取丙烷、四氟乙烷、正丁烷、正丁烷与乙醇混合溶剂亚临界萃取樟树叶，分析4 种溶剂亚临界提取樟树叶精油的化学成分；选取常见的植物病原真菌水稻纹枯病原菌Rhizoctonia solani、辣椒疫霉病原菌Phytophthora capsici和植物病原细菌青枯菌Ralstonia salanacearum、胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum作为供试菌，研究4 种不同樟树叶精油对植物病原菌的抑制作用，为樟树叶的深加工技术和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜樟树叶由广东华清园生物科技有限公司提供。培养基包括营养肉汤培养基（北京陆桥技术股份有限公司）；马铃薯琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；CPG 培养基：水解酪蛋白1 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，琼脂20 g，加水配制1 L 培养基。供试植物病原菌包括真菌病原菌：水稻纹枯病原菌、辣椒疫霉病原菌，由华南农业大学植物病理系提供；细菌病原菌：青枯菌、胡萝卜软腐果胶杆菌，购买于商城北纳创联生物科技有限公司。试验试剂包括丙烷（河南亚临界萃取技术研究院有限公司），四氟乙烷（霍尼韦尔，广州中冷贸易有限公司），正丁烷（河南亚临界萃取技术研究院有限公司），无水乙醇（西陇科学股份有限公司）。

1.2 试验设备

CBE-20 L 型亚临界萃取仪、CBEW-10 L 亚临界乙醇萃取仪、CBEW-5 L 亚临界水萃取仪（均由河南亚临界萃取技术研究院有限公司制造）；电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；YXQ-LS-75G 立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；ZHWY-211B 恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；SWCJ-1F 洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；LRH-250 生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；LAD-050FCI 空气能热泵烘干系统（广东瑞星新能源科技有限公司）；WN-200+水冷全能粉碎机（广州市旭朗机械设备有限公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程 新鲜樟树叶→烘干→粉碎→称重→滤袋盛装后置于萃取罐→亚临界流体萃取→溶剂分离回收→制得萃取物（计算得率）→抑菌作用测定。

1.3.2 不同溶剂亚临界萃取樟树叶 采用丙烷、四氟乙烷、正丁烷、正丁烷、正丁烷与乙醇混合溶剂（正丁烷与乙醇的体积比为9 ∶1）4 种不同溶剂分别按表1 中的工艺条件亚临界萃取樟树叶，得到相应的初提物。

表1 不同溶剂的亚临界萃取工艺Table 1 Subcritical extraction process with different solvents

1.3.3 樟树叶精油的纯化 所得萃取物用20 倍体积的无水乙醇溶解，于-18 ℃下冷冻24 h，过滤，除去不溶的蜡质、纤维等成分，滤液经旋转蒸发（40 ℃，0.01 MPa)，得樟树叶精油。计算得率[10]。樟树叶精油得率（%）=萃取得到的樟树叶精油质量/萃取的樟树叶质量×100。

1.3.4 樟树叶精油成分GC-MS 分析[11]（1）色谱柱：SH-Rxi-5Sil MS 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；（2）气相条件（GC）：升温程序：初始柱温为 70 ℃，以 2 ℃/min 速度升温至 160 ℃,保持2 min，再以 10 ℃/min 速度升温至220 ℃保持5 min，全程共运行 51 min。进样量 0.5 μL，采用分流的方式进样，进样口温度230 ℃。载气为氦气，过柱载气恒流速为1.19 mL/min。（3）质谱条件（MS）：离子源温度 200 ℃，接口温度 250 ℃，扫描范围（m/z）50～500。溶剂延迟3 min。（4）化合物鉴定：将总离子流图中各峰经质谱扫描后得到质谱图，通过标准质谱图库进行检索分析鉴定，并采用峰面积归一定量法计算各组分在挥发油中的相对百分含量。

1.3.5 樟树叶精油抑菌作用 （1）樟树叶精油配制：无菌条件下，将精油用少量二甲基亚砜（DMSO） 溶解配制成100 mg/mL 溶液。（2）真菌病原菌抑制试验：采用 PDA 平板对峙法[12]。用6 mm打孔器打取真菌菌饼移入到PDA 平板中央，在距菌饼约2 cm 处等距离呈等边三角形的3 点打孔，每个孔内加100 μL 樟树叶精油溶液，每处理3 次重复，以不加精油的处理为空白对照。28 ℃培养至空白对照菌落长满，测量各处理的菌落直径，计算抑制率。抑制率（%）＝（空白对照菌落直径－处理菌落直径）/空白对照菌落直径×100。（3）细菌病原菌抑制试验：滤纸片琼脂扩散法[13-14]。向灭菌好的培养皿中倒入约20 mL 的灭菌好的琼脂培养基，待其凝固后，加入100 μL 的细菌菌液(浓度调整为108CFU /mL)，均匀涂布后于 30 ℃细菌培养箱中静置 1 h。以平板中心点为中心，呈3 cm 等边三角形状放置直径 6 mm 的灭菌圆形滤纸片，用移液枪吸取20 μL 樟树叶精油弥散于滤纸上，每处理3 次重复，以不加精油的处理为空白对照。28 ℃恒温条件下黑暗培养，24 h 后观察精油对胡萝卜软腐果胶杆菌的抑菌效果，48 h 后观察精油对青枯菌的抑菌效果，用十字交叉法测量抑菌圈直径（d）。抑菌强度按以下标准判定：当d＞1.5 cm 时，表示高度抑菌（S）；当1.0 cm≤d≤1.5 cm 时，表示中度抑菌（I）；当0 cm ≤d＜1.0 cm 时，表示低度抑菌（R）[15]。

1.4 数据处理方法

采用SPSS17.0 及Microsoft Excel 2007 软件对数据进行分析，试验数据为平均值±标准差。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以最小显著性差异法（LSD）多重比较检验不同处理之间的差异显著性(α ＝0.05)。

2 结果与分析

2.1 亚临界初提物的物理形态和精油得率

樟树叶亚临界初提物的物理形态及得率见表2。4 种亚临界初提物状态各不相同，有浑浊、沉淀和分层的现象，所得初提物均有浓郁的龙脑香味。正丁烷与乙醇混合溶剂提取物有明显分层现象。采用正丁烷与乙醇混合溶剂萃取樟树叶精油，乙醇在一定程度上增大了溶剂体系的极性，提取物中醇溶性成分较多，在初提物纯化为精油的处理中损失较少，所以精油得率最高，为3.67%。

表2 樟树叶4 种亚临界初提物的性状和精油得率Table 2 Properties of subcritical primary and essential oil yield extracts from camphor leaves

2.2 不同溶剂亚临界萃取樟树叶精油的化学成分分析结果

将樟树叶精油经GC-MS 检测得到的总离子流图进行谱库匹配和人工鉴定，使用峰面积归一化法确定各化学成分的相对含量，分析结果见表3。在丙烷、四氟乙烷、正丁烷、正丁烷与乙醇混合溶剂提取的4 种樟树叶精油中分别鉴定出29、33、34 和22 种化合物，相对总含量分别为94.91%、95.66%、94.87%、95.07%。4 种叶精油的化学组分均以醇类和烯烃类化合物为主，其中醇类有7～8种，相对含量在63.68%～83.14%之间；烯烃类有12～22 种，相对含量在9.77%～29.46%之间；除此以外，还检测出酯类化合物1～2 种，以及酮类化合物1 种。

表3 4 种樟树叶精油的GC/MS 分析结果Table 3 GC / MS analysis results of four essential oils from camphor leaves

类别Category序号Number保留时间/min Retention time化合物Compound相对含量/%Relative content丙烷Propane四氟乙烷Tetrafluoroethane正丁烷Butane正丁烷与乙醇混合溶剂Butane + ethanol 18 31.911 4(14),11-桉叶二烯Eudesma-4(14),11-diene - - - 0.8 19 31.476 大根香叶烯D Germacrene D 3.36 3.95 3.07 2.46 20 31.915 α-古芸烯α-Gurjunene 8.4 8.73 7.74 -21 32.365 大根香叶烯B Germacrene B 2.58 2.8 2.41 1.74 22 33.016 α-布藜烯α-Bulnesene 0.35 0.40 - -23 33.827 δ-杜松烯δ-Cadinene 0.22 0.21 0.15 -24 36.031 α-愈创烯α-Guaiene 0.87 - 0.39 -25 36.032 γ-榄香烯γ-Elemene - 0.55 0.79 -26 37.383 氧化石竹烯Caryophyllene oxide - 0.34 0.28 -27 38.682 γ-芹子烯γ-Selinene 0.79 0.55 0.31 -醇类Alcohols 28 7.353 桉叶油醇Eucalyptol 1.33 1.56 1.18 1.16 29 8.745 松油醇Terpineol 0.16 0.2 0.15 0.12 30 9.929 芳樟醇Linalool - - - 0.1 31 13.417 龙脑Borneol 44.91 43.85 45.41 50.44 32 13.894 松油烯-4-醇4-Terpineol 0.28 0.37 0.27 0.27 33 14.648 α-松油醇α-Terpineol 0.83 - - -34 37.173 匙叶桉油烯醇Spathulenol - 0.66 0.63 -35 39.884 6-芹子烯-4-醇Selina-6-en-4-ol 16.6 14.57 15.26 0.86 36 45.136 喇叭醇Ledene alcohol 1.07 0.81 0.76 -37 50.447 叶绿醇Phytol - 0.56 4.60 29.45酯类Esters 38 3.02 2-辛基环丙烷十二酸甲酯Cyclopropanedodecanoic acid, 2-octyl-, methyl ester--0.02 -39 19.612 左旋乙酸冰片酯Bornyl acetate 2.02 2.33 0.81 2.05 Ketones 40 12.108 樟脑Camphor 0.85 1.1 0.81 0.74酮类

4 种樟树叶精油共同鉴定出的化合物有18 种，其中10 种烯烃类（α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、D-柠檬烯、大根香叶烯B、大根香叶烯D、α-侧柏烯、桧烯、β-水芹烯）、1 种芳香烃类（β-伞花烃）、5 种醇类（桉叶油醇、松油醇、龙脑、松油烯-4-醇、6-芹子烯-4 醇）、1 种酯类（左旋乙酸冰片酯）和 1 种酮类（樟脑）。龙脑是4 种樟树叶精油的主要化学成分，相对含量在43.85%～50.44%之间，以正丁烷与乙醇混合溶剂提取的叶精油中龙脑的相对含量最高。

4 种樟树叶精油中除龙脑外，其他的一些化学成分也是医药、化工等行业重要的工业原料。不同溶剂提取物中非龙脑的化学成分含量在49.56%～56.15%之间，其中相对含量超过 1% 的化学成分有7 种：α-蒎烯、D-柠檬烯、大根香叶烯B、大根香叶烯D、桉叶油醇、6-芹子烯-4-醇、左旋乙酸冰片酯，结果如图1 所示。

图1 4 种樟树叶精油中相对含量超过1%的非龙脑化学成分Fig. 1 Chemical constituents other than borneol in the four essential oils from camphor leaves with a relative content of more than 1%

2.3 不同溶剂亚临界萃取樟树叶精油的抑菌作用

4 种樟树叶精油对真菌病原菌和细菌病原菌的抑制作用如表4、表5 和图2 所示，对真菌类病原菌水稻纹枯病菌的抑制率在66.07%～88.65%之间，辣椒疫霉病菌的抑制率在41.01%～64.94%之间；对细菌类病原菌青枯病菌的抑菌圈直径在1.23±0.12～2.72±0.10 cm 之间，除正丁烷提取的樟树叶精油对该菌表现中度抑菌，其余3 种精油均表现高度抑菌；胡萝卜软腐果胶杆菌的抑菌圈直径在1.01±0.12～2.33±0.12 cm 之间，四氟乙烷、正丁烷与乙醇混合溶剂2 种溶剂提取的樟树叶精油对该菌高度抑菌，其余2 种精油表现为中度抑菌。4 种樟树叶精油对两类病原菌的抑菌作用之间存在显著差异，其中，以四氟乙烷为溶剂亚临界提取的樟树叶精油的抑菌效果最优，对两类病原菌均表现良好的抑菌作用，对真菌类病原菌水稻纹枯病菌和辣椒疫霉病菌的抑制率分别为88.65%、64.94%；对细菌类病原菌青枯病菌和胡萝卜软腐果胶杆菌的抑菌圈直径分别为2.72±0.10 cm、2.33±0.12 cm。

表4 4 种樟树叶精油对真菌病原菌的抑制作用Table 4 Antibacterial effect of four essential oils from camphor leaves on fungal pathogens

表5 4 种樟树叶精油对细菌病原菌的抑制作用Table 5 Antibacterial effect of four essential oils from camphor leaves on bacterial pathogens

图2 四氟乙烷亚临界萃取樟树叶精油的抑菌效果Fig. 2The antibacterial effect of essential oil from camphor leaves extracted with tetrafluoroethane

3 结论与讨论

本研究以樟树叶为原料，采用丙烷、四氟乙烷、正丁烷、正丁烷与乙醇混合溶剂4 种不同溶剂分别进行亚临界萃取得4 种樟树叶精油。利用GC/MS 法分析4 种樟树叶精油，共鉴定出40 种化合物，成分组成以醇类、烯烃类两大类化合物为主，其中醇类有7～8 种，相对含量在63.68%～83.14%之间；烯烃类有12～22 种，相对含量在9.77%～29.46%之间。正丁烷与乙醇混合后，烯烃类物质种类和相对含量明显减少，醇类物质的相对含量明显增加，叶绿醇、龙脑相对含量增加最为明显。添加极性强的乙醇作混合夹带剂，在一定程度上增大溶剂体系的极性，提取物中醇溶性成分较多，这与王甜等[16]利用正丁烷＋乙醇 （夹带剂）亚临界萃取滁菊精油的研究结果一致。研究中以正丁烷为溶剂亚临界萃取樟树叶精油的化学成分与周海旭等[8]利用正丁烷亚临界萃取的樟树叶精油的化学成分有差异性，这可能与樟树叶种类和种植区域不同有关。文献中樟树叶采集自湖南省长沙市，主要化学成分为桉油精（24.74%），研究中樟树叶采集自广东省平远县，主要化学成分龙脑（45.41%）。4 种樟树叶精油主要化学成分均为龙脑，相对含量在43.85%～50.44%之间，以正丁烷与乙醇混合溶剂提取的精油中龙脑相对含量最高。

4 种樟树叶精油对真菌病原菌和细菌病原菌均有不同程度的抑制作用。这与丁雄等[17]研究龙脑樟鲜叶挥发油对细菌、酵母菌和霉菌均有一定的抑菌作用的结果一致。其中四氟乙烷萃取的樟树叶精油抑菌效果最优，对两类病原菌均表现良好的抑菌作用。本研究首次以丙烷、四氟乙烷、正丁烷与乙醇混合溶剂亚临界萃取樟树叶，并研究4种樟树叶精油对植物病原菌的抑制作用，为樟树叶的深加工提供新技术，同时也为樟树叶精油在各领域的广泛应用提供参考依据。