UHPLC法快速测定坚果炒货中4种抗氧化剂含量

周迎春，杨盛茹，华向美，李单单，贺金涛

1.河南进口肉类指定口岸漯河查验区服务中心，河南 漯河 462300 2.河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450046 3.中华人民共和国漯河海关，河南 漯河 462000

为减少食品在生产储存运输过程中因氧化而褪色、变色、变质、出现哈喇味，降低食品中多环芳烃和氧化多环芳烃等有害污染物的产生，抗氧化剂常被直接添加到食品中或涂抹于食品包装材料内壁[1-3]。常用的食品抗氧化剂有叔丁基对羟基茴香醚(BHA)[4]、二丁基羟基甲苯(BHT)[5]、特丁基对苯二酚(TBHQ)和没食子酸丙酯(PG)[6]等。坚果炒货类食品因富含油脂和脂肪酸易被氧化而变质，产生哈喇味等不良口感，造成安全隐患[7-9]，抗氧化剂的添加可以有效预防氧化反应的发生，但是过量使用抗氧化剂会危害机体健康[10]，具有致癌[11]、抑制人体呼吸酶活性[12]、致突变[13]的危险。许多国家对抗氧化剂的使用限量作了明确规定[14]，日本及欧盟等国家禁止TBHQ等抗氧化剂在任何食品中添加使用[15]。GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中规定，在坚果炒货中BHA、BHT、TBHQ不得超过200 mg/kg，PG不得超过100 mg/kg。

目前，抗氧化剂测定有气相色谱法[16]、气相色谱质谱联用法[17]、液相色谱法[18]、液相色谱质谱联用法[19]及比色法[20]等，以液相色谱法应用最广[21]，而超高效液相色谱法(UHPLC)具有出峰速度快、灵敏度高及分离度好的显著优势。作者对比了两种前处理方法，建立一种快速测定坚果炒货中4种抗氧化剂含量的UHPLC方法，该法快速高效、灵敏度高、回收率好。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

开心果、油炸花生和兰花豆等：市售。

甲醇、乙腈：色谱纯，美国fisher试剂公司；BHA、BHT、TBHQ(纯度分别为99.1%、99.9%、99.7%)：坛墨质检标准物质中心；PG(纯度为98.8%)：上海安谱实验科技股份有限公司；试验用水均由美国Millipore公司生产的Milli-Q超纯水系统制得；PS/DVB SPE柱(500 mg/6 mL)：月旭科技(上海)股份有限公司；ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、HILIC Core-shell(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)和CORTECS C18(50.0 mm×4.6 mm，2.7 μm)：沃特世科技(上海)有限公司。

1 mg/mL混合标准品储备溶液：取BHA、BHT、TBHQ、PG各100 mg用乙腈溶解并定容至100 mL，摇匀，4 ℃避光保存。

混合标准工作溶液：移取适量体积1 mg/mL混合标准品储备溶液分别稀释至20、50、100、200、400 mg/L，现配现用。

1.2 仪器与设备

AcQuity Arc超高效液相色谱仪(配有PDA检测器)：美国Waters公司；5810R离心机：德国Eppendorf公司；KQ 5200DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；XPE 205分析天平：瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱柱和流动相的选择

考察了3种色谱柱(ACQUITY UPLC BEH Amide、HILIC Core-shell和CORTECS C18)对BHA、BHT、TBHQ、PG 4种抗氧化剂的分离效果。选择效果较好的色谱柱，比较乙腈和甲醇作为有机相时对4种抗氧化剂的峰形及分离度的影响。

1.3.2 样品前处理

方法一：参照GB 5009.32—2016《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》。准确称量样品1.0 g(精确至0.01 g)，置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋振荡2 min，超声10 min，3 000 r/min离心5 min，收集上清液于离心管中，再使用10 mL乙腈溶液重复提取1次，合并2次上清液，待净化。将上清液全部加载到SPE柱上(使用前须经5 mL甲醇活化，5 mL乙腈平衡)，收集流出液，再用10 mL溶液(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶ 2)洗脱，收集流出液。合并收集液于旋蒸瓶中，40 ℃旋干，并用乙腈复溶，定容至2 mL，过0.45 μm滤膜，滤液备用。

方法二：参照NY/T 1602—2008《植物油中叔丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和特丁基对苯二酚(TBHQ)的测定 高效液相色谱法》。准确称量样品5.0 g(精确至0.01 g)，置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋振荡10 min，3 000 r/min离心5 min，取上清液于25 mL容量瓶中，残余物重复提取1次，上清液合并于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，经0.45 μm有机滤膜过滤，滤液备用。

1.3.3 检出限与定量限的测定

取混合标准工作溶液上机测定。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，自动生成校准曲线，4种抗氧化剂线性范围10～200 mg/L。根据GB/T 27404—2008要求确定方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.3.4 准确度和精密度的验证

取未加抗氧化剂的开心果、油炸花生分别做三水平加标，选择前处理效果好的方法进行处理后上机测定，重复测定7次并计算回收率以及相对标准偏差(RSD)，验证方法的准确度和精密度。

1.3.5 实际样品检测

用所建立的方法对开心果、油炸花生和兰花豆等共计24批次的样品中BHA、BHT、TBHQ、PG 4种抗氧化剂含量进行检测，每个样品做2个平行。

1.4 数据处理

图谱的采集及定量分析采用EmpowerTM3软件，试验数据采用Excel 2016制图及分析。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

由图1可知，前两种色谱柱均无法有效分离4种抗氧化剂，而CORTECS®C18色谱柱可以使4种抗氧化剂分离，且分离度好、峰形对称。ACQUITY UPLC BEH Amide作为正相色谱柱更适合中性化合物的分析，4种抗氧化剂难以得到有效保留；HILIC Core-shell色谱柱适合分析弱极性化合物中极性更强的物质，4种抗氧化剂保留效果差，不能有效定性和定量；CORTECS C18作为反相色谱柱适合分析弱极性化合物中极性更弱的物质，由于4种抗氧化剂属于弱极性化合物，因此可在CORTECS C18色谱柱中得到更有效的保留，从而获得更好的分离度和峰形，可满足定性和定量分析。

注：a为ACQUITY UPLC BEH Amide；b为HILIC Core-shell；c为CORTECS C18。图1 3种色谱柱分离效果Fig.1 Separation effect of three kinds of chromatographic columns

2.2 流动相的选择

在CORTECS C18色谱柱中，利用乙腈作为有机相时，4种抗氧化剂不易保留，且分离度差，而甲醇作为有机相时，4种抗氧化剂保留效果好，信号响应更强，且容易分离，这与反相色谱柱中乙腈的洗脱能力大于甲醇有关。由图1c可知，用纯水作为水相时，4种待测目标物均有严重的拖尾现象，峰形相对较差。由图2可知，0.5%(V/V)甲酸水溶液可以有效改善峰形，4种抗氧化剂在8 min内即可有效分离，远远低于GB 5009.32—2016《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》中的30 min。因此，试验流动相选择A为0.5%(V/V)甲酸水溶液、B为甲醇，流速0.5 mL/min，进样量10.0 μL。为了缩短出峰时间、高效分离目标物和除去色谱柱中残留杂质，进而降低基质对目标物的干扰，参照文献[22]设计流动相梯度洗脱程序，见表1。

图2 水相为0.5%(V/V)甲酸水溶液时的色谱图Fig.2 Chromatogram with 0.5% (V/V) formic acid aqueous solution as the aqueous phase

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

2.3 两种前处理方法效果比对

取未加抗氧化剂的开心果可食用部分，粉碎均匀后，分别准确称取1.0、5.0 g，按照200 mg/kg的加标量，加入适量4种抗氧化剂标准溶液，依次依照1.3.2中方法一和方法二分别进行前处理后取滤液上机检测，滤液的理论质量浓度分别为100、40 mg/L，实际测定的液相色谱图分别见图3和图4。由图3和图4可知：方法一与方法二中PG和TBHQ都有很好的响应，但是方法一中BHA与BHT的响应都明显低于方法二，且BHT的响应为0，而在方法二中响应良好。这表明方法二更适合用于开心果中4种抗氧剂含量的测定。

2.4 方法学验证

2.4.1 检出限及定量限

4种抗氧化剂的线性方程、相关系数(R)、检出限(LOD)及定量限(LOQ)见表2。由表2可知，4种抗氧化剂在10～200 mg/L范围内线性均良好，R均大于0.998，符合GB/T 27404—2008的要求。GB 5009.32—2016《食品安全国家标准食品中9种抗氧化剂的测定》中PG、TBHQ、BHA、BHT的LOD分别为2、10、10、4 mg/kg，LOQ均为20 mg/kg，该研究中LOD和LOQ均明显低于GB 5009.32—2016中的方法检出限和定量限。可见，该方法灵敏度高，具有明显优势。

图3 方法一中加标样品的液相色谱图Fig.3 Liquid chromatogram of the spiked sample with method 1

图4 方法二中加标样品的液相色谱图Fig.4 Liquid chromatogram of the spiked sample with method 2

2.4.2 回收率及精密度

由表3和表4可以看出，4种抗氧化剂的平均回收率在95.06%～104.31%之间，RSD为0.1%～2.1%。表明该方法具有很好的准确度和精密度，结果符合GB/T 27404—2008的要求，可用于坚果炒货中4种抗氧化剂含量的测定。

2.5 实际样品检测

利用试验所建立的方法对开心果、油炸花生和兰花豆等共计24批次的样品中BHA、BHT、TBHQ、PG 4种抗氧化剂含量进行检测，结果见表5—表7。结果表明：实际样品中4种抗氧化剂检测结果均小于GB 2760—2014中规定的最大使用量。

表2 4种抗氧化剂的线性方程、R、LOD和LOQTable 2 Linear equations, value of R, LOD and LOQ of the four antioxidants

表3 开心果中4种抗氧化剂的平均回收 率和RSD (n=7)Table 3 Average recoveries and RSD of the four antioxidants in pistachio (n=7)

表4 油炸花生中4种抗氧化剂的平均回收率 和RSD (n=7)Table 4 Average recoveries and RSD of the four antioxidants in fried peanuts (n=7)

表5 开心果中抗氧化剂含量Table 5 The antioxidant content in pistachio sample

表6 油炸花生中抗氧化剂含量Table 6 The antioxidant content in fried peanuts sample

表7 油炸兰花豆中抗氧化剂含量Table 7 The antioxidant content in deep-fried orchid beans sample

3 结论

利用超高效液相色谱仪确立一种快速测定坚果炒货中4种抗氧化剂含量的方法，通过对比样品前处理的2种方法表明：GB 5009.32—2016和方法二中PG和TBHQ都有很好的响应，但是国标法中BHA和BHT的响应都明显低于方法二，且BHT的响应为0，而在方法二中响应良好。同时方法二前处理无须SPE柱，检出限、定量限低。与国标法相比，UHPLC法具有快捷高效、低成本、灵敏度高、回收率好等明显优势，可用于大批量地检测坚果炒货中4种抗氧化剂的含量。实际样品的检测结果表明坚果炒货中4种抗氧化剂超出最大使用量的风险较低。后期研究中可扩大实际样本范围及数量，以建立起有效的风险评估。