柴胡皂苷D对人三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响

杨楠 冯苗苗 岂铭伟 严晓丽 王明娟 薛晶

(承德医学院 1护理系，河北 承德 067000；2基础医学院)

我国女性恶性肿瘤发病率排第1位的是乳腺癌，其病死率排第5位，是临床常见恶性肿瘤之一。近1/4乳腺癌患者为三阴乳腺癌(TNBC)，TNBC有高侵袭、恶性程度高、易转移和预后差等特点〔1，2〕。柴胡根茎中分离出的三萜皂苷柴胡皂苷(SSs)具有多重药理作用。其中，柴胡皂苷(SS)D的中药理活性最强，能逆转肿瘤细胞的耐药性，通过抑制肿瘤细胞增殖分裂和阻断细胞周期，从而促进细胞凋亡〔3〕。据报道，SSD抑制细胞生长或诱导细胞凋亡的作用在肾癌、胶质瘤、甲状腺癌、肝癌等恶性肿瘤中都有体现〔4～7〕。但SSD对人TNBC细胞MDA-MB-231增殖的影响和作用机制尚未报道，本实验拟研究其对人TNBC细胞MDA-MB-231增殖的影响及机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 人TNBC细胞株MDA-MB-231细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(TCHu227)。

1.1.2药物 SSD购自四川省维克奇生物科技有限公司(wkq17102505)。

1.1.3试剂 兔抗人CX43多克隆、兔抗人mTOR单克隆(杭州华安生物，中国)；兔抗人P70s6K多克隆(武汉ABcolnal公司，中国)；羊抗兔二抗(Redpartytech，美国)；放射沉淀免疫试验(RIPA)裂解液〔含苯甲基磺酰氟(PMSF)，solarbio，中国〕；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、电化学发光(ECL)液(杭州联科，中国)；蛋白上样缓冲液、样品缓冲液(5X)(贝博，中国)；新快速十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒、10×的SDS-PAGE液、Western印迹转膜缓冲液(20×)(庄盟，中国)；TBS/Tween缓冲液(10×)、三色预染蛋白Marker、Western印迹一抗稀释液、Western印迹二抗稀释液(雅酶，中国)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜0.45 μm(GE，中国)；PVDF膜0.22 μm(ROCHE，瑞士)；β-actin兔单抗(武汉ABcolnal公司，中国)。

1.1.4仪器 垂直电泳槽、水平摇床(北京六一，中国)；3KE5型低温离心机(Sigma，美国)；TE212-L型电子天平(Sartorius公司，德国)；TANON-6100型显影仪器(Tanon，中国)；倒置显微镜(Thermo，美国)；水浴锅(美的，中国)；-80℃低温冰箱(海尔，中国)；680型酶标仪(BIO-RAD，美国)；DU800型紫外可见分光光度计(BECKMAN COULTER，美国)；DYY-6B型稳压稳流电泳仪(信然实业有限公司，中国)；DHG-9146A型热恒温鼓风干燥箱(精宏实验设备有限公司，中国)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 常规复苏MDA-MB-231细胞后，培养于DMEM培养液(含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素)中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，用0.25%胰酶消化进行传代培养，取之后3 d处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞活力 单细胞悬液经0.25%胰酶消化后接种于96孔板中(1×104个/孔)，设置6个平行孔，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，吸出孔内培养液，分别加入含不同浓度SSD(0、1、5、10、20、50、100 μmol/L)的培养基处理细胞，24 h后加入20 μl MTT(5 mg/ml)继续培养4 h。弃去培养基后，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物溶解。最后用酶标仪检测各孔OD值(检测波长为490 nm)，记录结果并计算各组存活率，细胞存活率(%)=各组的吸光度值/对照组的吸光度值×100%。

1.2.3Western印迹检测人缺氧诱导因子(HIF)-I、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)-6、血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达 取对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于100 mm培养基中，常规培养24 h贴壁后，吸去DMEM培养基，分为对照组(不加入SSD)和实验组(加入20 μmol/L的SSD)，每皿10 ml，每组3个重复。药物处理24 h后弃去培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后加适量裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上静置裂解40 min取出，于4℃离心机上以3 000 r/min离心5 min左右，取上清液进行BCA法测定所提取的蛋白质浓度。调整蛋白浓度进行10%SDS-PAGE分离，将蛋白转移到PVDF膜上，TBST漂洗1次后5%脱脂奶粉摇床封闭2 h，分别加入适量稀释后一抗兔抗人CX43多克隆(1∶2 000)、兔抗人mTOR单克隆(1∶1 000)、兔抗人P70s6K多克隆(1∶2 000)、β-actin兔单克隆 (1∶1 000)，4℃摇床孵育过夜；TBST洗膜15 min第一次，10 min×2次，分别加入相应二抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(1∶3 000，应用于IGFBP-6、β-actin、VEGF)、山羊抗小鼠(1∶5 000，应用于HIF-1)，室温摇床孵育1 h，TBST 洗涤5 min×3次，取出PVDF膜，沥干膜上的洗膜液，将ECL液均匀加在PVDF膜确保覆盖整张膜，包好避光孵育1～2 min，置于Bio-rad自动显影仪进行目的蛋白显影，保存图像后进行图像分析。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组MDA-MB-231细胞存活率比较 1、5、10、20、50、100 μmol/L SSD对MDA-MB-231细胞存活率〔(101.00±3.91)%、(94.51±4.51)%、(90.51±6.17)%、(77.60±5.10)%、(65.00±8.50)%、(50.89±3.81)%〕呈剂量依赖性，且20、50、100 μmol/L SSD细胞存活率显著低于对照组〔(100.00±6.64)%,P<0.05〕。

2.2各组MDA-MB-231细胞周期相关因子水平比较 与对照组比较，实验组HIF-1、VEGF蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05，P<0.01)，IGFBP-6蛋白相对表达量均显著升高(P<0.05)。见图1，表1。

图1 各组MDA-MB-231细胞周期相关因子蛋白的表达

表1 各组MDA-MB-231细胞周期相关因子蛋白表达的影响

3 讨 论

乳腺癌是严重影响女性健康的恶性肿瘤之一且发病率逐年呈上升趋势〔8〕。SSD在抗炎、抗氧化和抗癌方面均有作用〔9〕。其抗癌的机制主要是通过诱导癌细胞分化、凋亡，从而抑制癌细胞的生长，或者调节免疫并调控癌细胞自噬等〔10〕。细胞周期进程介导细胞增殖分裂，当细胞缺失周期调控功能时可能会导致细胞增殖和凋亡失衡形成癌细胞。因此，细胞周期的调控已成为消除癌细胞的有效策略之一〔11〕。本研究结果说明诱导细胞凋亡可能通过SSD调节凋亡相关基因的表达而实现。VEGF可促进血管通透性增加和血管生成。研究发现，VEGF的表达与乳腺癌患者肿瘤直径、临床分期和淋巴结转移均呈正相关，提示VEGF与乳腺癌患者的疾病进展和不良预后有关〔12，13〕。HIF-1在肿瘤中可参与糖酵解途径和葡萄糖的转运，从而影响肿瘤代谢，甚至促进肿瘤的恶性转变和抗放化疗等〔14〕。IGFBPs家族中的IGFBP-6在许多组织中都能广泛表达，魏峰等〔15〕研究发现信号素(SEMA3B)可通过促进IGFBP-6的表达，发挥肿瘤抑制作用。

综上，SSD可能通过降低MDA-MB-231细胞周期相关因子HIF-I、VEGF蛋白的表达，同时升高细胞周期相关因子IGFBP-6蛋白的表达，抑制细胞增殖，以达到治疗TNBC的目的。