不吸烟非小细胞肺癌患者发病潜在关键基因鉴别

黄河 李成长 彭燕 姜洪波

(1新乡市中心医院(新乡医学院第四临床学院)呼吸与危重症医学科一，河南 新乡 453000；新乡医学院 2基础医学院生理学与疾理生理系；3第三附属医院营养科)

肺癌是肿瘤相关死亡的主要病因之一。导致肺癌的因素很多，吸烟是引起肺癌重要的因素之一〔1〕，可以导致多种类型的肺癌发生，如小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌〔2，3〕，该方面的研究也较多，但相当一部分肺癌患者从不吸烟〔4〕，他们易罹患非小细胞肺癌(NSCLC)且大部分属于肺腺癌(ADC)，这方面的研究较少，发病原因及其分子机制尚不明确〔5〕，此外，对于相同的治疗方案，吸烟人群和非吸烟人群NSCLC的治疗效果并不一致〔6〕，提示两者发病机制并不相同。目前几乎所有肺癌治疗的靶向药物在治疗过程中都会出现继发耐药现象〔7〕，目前尚未发现有关NSCLC患者中NCAPG基因的相关研究报道。本研究通过检索美国国立卫生研究院GEO数据库的基因表达谱数据，探讨非吸烟肺癌患者NSCLC发病的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1基因表达谱数据的获取 检索GEO数据库(Gene Expression Omnibus)，选取GSE19804和GSE31210两个基因表达谱数据集作为研究对象，其中，GSE19804包含来自非吸烟人群的60例肿瘤组织样本和60例正常组织样本。GSE31210数据集同时包含吸烟与非吸烟人群的标本，仅从该数据集中选取不吸烟人群作为研究对象，包括含115例肿瘤组织样本和8例正常组织样本。

1.2差异基因的筛选 基于R语言的差异基因在线分析工具GEO2R对两个基因表达谱数据集分别进行差异表达分析，获得差异表达基因(DEGs)，差异表达基因的筛选条件为校正后P<0.05和|log2FC(fold change)|>1。然后利用火山图可视化显著差异表达基因。 最后，对两个基因差异表达分析结果取交集，作为最终的差异表达基因。

1.3GO 和KEGG通路富集分析 DEGs的GO富集分析主要包括生物过程、分子功能和细胞组成3个方面。 使用京都基因与基因组百科全书(KEGG)对DEGs相关的生物学通路进行富集分析。DAVID是一个强大的在线基因功能富集分析工具，本研究主要使用DAVID进行GO和KEGG信号通路进行富集分析，P<0.05和基因数大于10作为显著富集的纳入标准。

1.4蛋白互作网络的构建与关键基因的鉴别 基于STRING数据库利用DEGs构建蛋白-蛋白互作(PPI)网络。为对数据进行进一步的分析，将蛋白互作信息导入Cytoscape软件。基于Cytoscape的内置插件Cytohubba对网络进行拓扑结构分析，基于MCC算法对PPI网络中的节点按照度值排序，选取度值排名前10位的基因为关键基因。

1.5生存分析 利用Kaplan Meier plotter和GEPIA在线生存分析工具对所鉴别的关键基因进行生存分析，研究关键基因高表达与NSCLC患者生存时间的关系。参数均采用网站默认设置，P<0.05代表关键基因高表达与患者生存时间显著相关。

2 结 果

2.1差异表达基因的筛选 使用基于R语言的GEO2R在线分析工具分别对GSE19804和GSE31210两个基因表达谱数据集中不吸烟人群的NSCLC肿瘤组织和正常肺组织样本进行差异表达基因分析。结果显示：GSE19804表达谱差异分析共得到456个上调DEGs和950个下调DEGs；GSE31210表达谱差异分析共产生1 342个上调DEGs和1 413个下调DEGs。上述两个基因表达谱数据差异表达基因的分布情况最终用火山图可视化展示，见图1。对两组基因的上调和下调基因分别取交集，其中上调DEGs 343个、下调DEGs 679个，两个基因表达谱差异表达分析共得到1 022个共有DEGs。

虚线上灰色点代表上调基因，虚线下灰色的点代表下调基因，黑色的点代表在肿瘤和正常组织中表达差异不显著的基因图1 GSE19804 和GSE31210基因表达谱数据集基因差异表达分析结果的火山图

2.2共有DEGs的GO与KEGG通路富集分析 以P<0.05且基因数大于10作为显著富集的纳入标准，对共有DEGs进行GO和KEGG通路富集分析。选取富集显著水平排名前10的GO词汇和通路进行可视化展示，见图2。结果显示，GO富集显著的生物学过程主要包括细胞黏附、细胞外基质组织、血管生成、个体细胞间黏附、白细胞迁移、细胞表面受体信号通路、受体内化、血管生成的正调控等方面。显著富集的GO分子功能主要体现在肝素结合、钙离子结合、金属内肽酶活性、金属肽酶活性、碳水化合物结合、胶原结合、转录激活子活性、RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区域序列特异性结合、Ras鸟苷核苷酸交换因子活性、肌动蛋白结合。显著富集的GO细胞组分包括细胞外区域、细胞外空间、蛋白细胞外基质、质膜、质膜的组成部分、膜筏、细胞表面、细胞外泌体、细胞外基质、膜的组成部分等。显著富集信号通路包括细胞黏附分子(CAMs)、细胞周期、细胞外基质-受体相互作用、癌症相关转录失调等。

A代表GO生物学过程富集分析结果，B代表GO分子功能富集分析结果，C代表GO细胞组分富集分析结果，D代表KEGG通路富集分析结果。柱状图长度(-log10 P值)代表富集显著程度图2 GO和KEGG富集

2.3PPI网络的构建 为从系统角度展现与肺癌发生密切相关的重要基因及它们之间的互作关系。将共有DEGs输入到STRING数据库，采用默认参数构建PPI，所构建PPI网络节点数为945，边数为6033，平均节点度为12.8，局部聚类系数为0.343，PPI富集P值<0.05。提示网络图中各基因直接有明显的互作关系。

2.4关键基因鉴别 PPI网络是典型的无标度网络，节点间的连接状况具有高度不均匀分布性，仅少数基因与多个基因之间存在相互作用，大多数基因只与很少量的其他基因存在互作关系，网络中少数与其他基因间存在大量互作关系，具有较高的连接度值，处于PPI 网络中的关键位置，被称为关键基因(Hub gene)。在本研究中，按照连接度值，选取排名前10的基因为关键基因，分别是CDK1、CCNB1、BUB1B、CCNB2、AURKA、MAD2L1、CDC20、CCNA2、BUB1、NCAPG，见图3。

深色节点为根据MCC算法选取的关键基因，白色节点是与这些关键基因有直接互作关系的相邻节点图3 基于MCC算法所选取的关键基因及与有直接互作关系的节点形成的蛋白互作网络

2.5生存分析 选取排名前10的关键基因进行Kaplan Meier生存分析，其中CDK1通过GEPIA在线工具分析完成，其余9个关键基因利用Kaplan Meier plotter完成，结果表明本文鉴别的所有关键基因高表达与肺癌人群的总体存活时间减少存在显著的相关性(P<0.05)，见图4。

图4 6个代表性关键基因的Kaplan Meier生存分析结果

3 讨 论

肺癌是一种发病率与致死率都很高的疾病，研究表明，每年约有120万人死于该病〔8〕。NSCLC是肺癌的一种亚型，发病率占肺癌患者的75%～80%，因此，NSCLC相关方面研究具有重要的理论与现实意义。富谷氨酸WD重复序列蛋白(GRWD)1过表达与肿瘤患者较差的预后密切相关，研究表明，GRWD1 可通过CDK1和 CCNB1促进NSCLC肿瘤细胞的细胞集落的形成〔9〕，这一研究结果提示CDK1和 CCNB1在NSCLC发生发展过程中发挥了重要作用。基于WGCNA方法的研究显示BUB1B 与CCNB2分别是与肺腺癌和鳞状细胞癌肿瘤疾病进展相关的关键基因，这一研究结论为本研究结果的可靠性提供了更多依据〔10〕。基因表达的定量实验研究显示，预后较差的NSCLC患者其AURKA基因表达量显著升高〔11〕，提示AURKA是预后不良的一个重要标志物。Pabla等〔12〕报道10个NSCLC细胞增殖关联基因BUB1、CCNB2、CDK1、CDKN3、FOXM1、KIAA0101、MAD2L1、MELK、MKI67和TOP2A与肿瘤对免疫检查点抑制剂(ICI)的耐药性相关。免疫组化实验表明，CDC20高表达的NSCLC患者预后相对较差〔13〕。Ruan等〔14〕发现CCNA2是NSCLC肿瘤细胞转移的关键调节剂，可作为靶向治疗NSCLC的新靶标。Gemma等〔15〕发现BUB1基因突变与有丝分裂检查点基因的突变与肿癌的发生发展有关。

NSCLC患者的肿瘤发病关键基因的研究目前已有部分报道，Chen等〔16〕对3个基因表达谱的研究共鉴别10个NSCLC关键基因，但仅有CDK1、PLK1、RAD51和RFC4 4个基因被证明与患者生存时间降低密切相关，Liu等〔17〕研究表明，CDK1、UBE2C、AURKA、CCNA2、CDC20、CCNB1、TOP2A、ASPM、MAD2L1和KIF11是NSCLC患者发病的关键基因。由于上述研究未对吸烟及未吸烟样本进行区分，研究对象的不同可能是引起与本研究结果不一致的重要原因。

综上，本研究共鉴别10个与不吸烟人群NSCLC患者肿瘤发生和进展密切关联的关键基因，其中NCAPG未见相关报道，这些基因的高表达与患者生存时间降低显著相关。