马齿苋炒炭前后凉血止血作用比较

李昕曈 王炳然 蒋常鹏 陈晶 高红梅 (长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117)

马齿苋是一种野生中药，始载于《神农本草经》具有清热凉血、抗炎、解毒、止痢等功效〔1～3〕。现代药理作用研究显示，马齿苋含有抗肿瘤物质，具有保护神经、调节骨骼肌、平滑肌等作用〔3，4〕。但目前国内外学者对马齿苋治疗血热出血药效的研究较少，故本实验通过建立大鼠血热出血模型来探讨马齿苋炒炭前后的凉血止血变化。

1 材料与方法

1.1试验药物 马齿苋药材购自河北凯达药业有限公司，经长春中医药大学有关专家鉴定为合格产品。云南白药(国药准字Z53020798)；干酵母(国药准字H44022243)。马齿苋炒炭的制备：取净马齿苋150 g，投入已预热30 min的炒药机中，于200℃炒制15 min，即得马齿苋炭〔5〕。

药液制备：取马齿苋及马齿苋炭适量2份，各自加10倍量的蒸馏水和70%乙醇，置于回流装置中提取2 h，回流后将中药渣加适量蒸馏水进行第2次回流，时间为1 h，把两次滤液混合摇匀，再减压浓缩至1 g/ml，即得马齿苋的水提取物(SS)和马齿苋的醇提取物(SC)。按上述方法制备得到马齿苋炭的水提取物(TS)和马齿苋炭的醇提取物(TC)。称量2.5 g云南白药粉用100 ml蒸馏水搅拌溶解，即所需0.025 g/ml的云南白药液。再称量20 g干酵母粉取100 ml蒸馏水搅拌溶解，即所需干酵母液，干酵母液注意现用现配。

1.2动物 SD大鼠，SPF等级，选取符合实验要求的体长18～20 cm健康大鼠42只，体重200～240 g，SD大鼠证号为SCXK(辽)2020-0001，经过长春中医药大学实验动物伦理委员会批准(2021057)。饲养条件为湿度57%～62%，室温22～25℃。

1.3试剂 大鼠血浆中内源性凝血因子活化部分凝血活酶时间(APTT)检测试剂盒(产品批次编号R0053)、血浆纤维蛋白原(Fib)试剂盒(产品批次编号R0079)、凝血酶时间(TT)试剂盒(产品批次编号49844)、凝血酶原时间(PT)试剂盒(产品批次编号R0059)、氯化钙溶液(CaCl2，产品批次编号R0053)、缓冲液(TC Buffer，产品批次编号R0043)，上述溶液均购自希森美康生物科技(无锡)有限公司；负压血样采集器2 ml〔抗凝剂：乙二胺四乙酸二钾(枸橼酸钠)，产品批次编号20191104〕、负压血样采集器2 ml(抗凝剂：EDTA-K2，产品批次编号20191101)，血样采集容器肝素钠1 ml(抗凝剂：肝素钠，产品批次编号200702)，购自广州健福医疗科技有限公司。

1.4仪器 数显自动恒温水浴锅(HH-2型，购自国华电器有限公司)；全自动自清洗血流变仪(LBY-N6B型)；全自动血凝分析仪(CA-600型)；全自动血细胞分析仪(ProcyteDx*型，购自爱德士公司)；低速离心机(TDL-80-2B型)；电子天平(JM-A5002型)。

1.5方法

1.5.1分组、造模及给药 42只健康大鼠按照雌雄各半原则，每组6只，共分为7组：血热出血组、阳性药物组(给予云南白药液)、SS组、SC组、TS组、TC组、对照组。各组大鼠给药采取灌胃方法，除血热出血组和对照组，各组给予药液为10 ml/kg，血热出血组与对照组大鼠进行灌胃给予10 ml/kg蒸馏水，每24 h给药一次，连续灌胃7 d。第7天开始造模，选取对照组的大鼠在其背部皮下注射10 ml/kg蒸馏水，其余各组背部皮下注射干酵母液10 ml/kg，注射5 h后，各组大鼠给予1 ml无水乙醇进行灌胃(对照组除外)，对照组给予1 ml蒸馏水进行灌胃。上述操作完成后观察大鼠1 h，1 h后对照组和血热模型组选择用蒸馏水进行灌胃，其他5组给药组灌胃相应受试药物，选择在造模前和造模后2、4、6、8 h测定各组大鼠肛温，记录肛温变化情况。第8天时，对大鼠最后一次灌胃给予相应受试药物治疗，操作方法同上，给药之后等待1 h，采用10%水合氯醛溶液对所有的大鼠进行注射麻醉，麻醉后静脉取血置于37℃恒温箱内。

1.5.2血液黏度指标的测定 取全血1 ml，肝素钠溶液全血抗凝，测定大鼠的全血中切黏度、全血低切黏度、全血高切黏度参数，进行记录。

1.5.3凝血功能指标的测定 取全血2 ml，于3.8%枸橼酸钠溶液中全血抗凝，3 000 r/min离心10 min进行分离，取上清血浆部分，测定Fib、PT、APTT、TT参数，进行记录。

1.5.4血液相关参数的测定 取全血2 ml，于EDTA-K2溶液中全血抗凝，测定血红蛋白计数(HGB)、血小板计数(PLT)、血细胞比容(HCT)、平均血小板体积(MPV)、红细胞(RBC)参数，进行记录。

1.5.5组织病理学检查 麻醉采血后，处死大鼠。解剖大鼠取肾、胃、肝、肺组织，用生理盐水清洗，肉眼目测大鼠脏器出血变化的状态。大鼠的肺部、胃部用中性甲醛溶液(浓度为10%)进行固定，切片，显微镜测定大鼠的肺部、胃部组织的病理切片参数，进行记录。

1.6统计学方法 采用SPSS26.0软件进行正态分布检验及完全随机设计的单因素方差分析。

2 结 果

2.1大鼠造模前和造模后肛温的情况 与对照组比较，血热出血组造模后2、4、6、8 h肛温显著升高(P<0.01)。除造模后6 h TS组及造模后8 h TS组和TC组与血热出血组比较差异无统计学意义外，SS组、SC组、TS组、TC组造模后各时间点肛温均显著低于血热出血组(P<0.05,P<0.01)。造模后2、4、6、8 h SS组肛温显著低于TS组(P<0.01)，SC组肛温显著低于TC组(P<0.01)。见表1。

表1 造模前和造模后各组肛温比较

2.2各组造模前和造模后血液黏度比较 与对照组比较，血热出血组全血低、中、高切黏度均显著升高(P<0.01)；与血热出血组比较，SS组、SC组显著降低全血低、中、高黏度(P<0.01)；TS组和TC组显著降低全血低切黏度(P<0.01),TS组显著降低全血中切黏度，TC组显著降低全血高切黏度(P<0.05)。SS组与TS组、SC组与TC组比较全血低、中、高切黏度均显著降低(P<0.01)。见表2。

2.3各组造模前和造模后凝血功能比较 与对照组相比，血热出血组Fib明显升高(P<0.01)，APTT、PT、TT时间增加显著(P<0.01)；与血热出血组比较，阳性药物组、SS组、SC组、TS组、TC组APTT、TT、PT显著缩短(P<0.05,P<0.01),SS组、SC组、TS组、TC组Fib显著降低(P<0.05，P<0.01)。TS组与SS组、TC组与SC组比较APTT、Fib、PT显著更低(P<0.01)。见表2。

表2 各组造模前和造模后全血黏度及凝血功能比较

2.4各组血液参数比较 与对照组相比，血热出血组RBC、HCT、HGB、MPV明显较高(P<0.01)。与血热出血组比较SS组、SC组明显降低HCT、HGB、RBC、MPV(P<0.05，P<0.01)；TC组明显降低模型大鼠的RBC、HCT含量(P<0.05)；各给药组与模型组分析数据比较，显示降低大鼠MPV含量，差异明显(P<0.05)；SS组与TS组、SC组与TC组比较RBC、HCT、HGB均显著降低(P<0.01)；PLT含量在各组间无显著性差异。见表3。

表3 各组血液参数比较

2.5大鼠造模前和造模后各组器官组织变化情况

2.5.1肉眼直接观察大鼠脏器变化 与对照组比较，血热出血组大鼠的肺、胃、肝部具有明显出血点，肾的颜色较深，说明该实验造模方法正确，数据可靠。各给药组与血热出血组进行对比分析，增强止血效果明显，出血点减少，颜色较淡。见图1。

图1 各组大鼠脏器形态

2.5.2肺部病理学组织切片 对照组大鼠的肺泡完整，无炎性物质渗出，无出血；血热出血组大鼠肺泡间隙有大量红细胞渗出，存在炎性浸润，部分肺泡结构明显被破坏；SS组和SC组改善肺间质炎性浸润，但仍有部分出血点；TS组和TC组可以有效改善肺泡腔内的红细胞浸润，减少出血点，效果优于SS组和SC组。见图2。

图2 各组肺组织情况(HE染色，×40)

2.5.3胃部病理学组织切片 对照组胃组织正常，上皮细胞呈现出单层柱状排列状态；血热出血组大鼠胃组织出现炎性细胞浸润状态；观察SS组和SC组显微图片可看出马齿苋能够改善部分模型大鼠的胃溃疡情况，但仍有少量出血点存在；TS组和TC组对大鼠胃组织细胞呈现出柱状排列状态，说明可明显改善炎症细胞浸润及红细胞浸润，见图3。

图3 各组胃组织情况(HE染色，×40)

3 讨 论

马齿苋(拉丁名为：Portulaca oleracea L.)生长期为1年生草本植物，叶片伏地扁平，呈淡绿色，叶片周围带有锯齿状，故得名马齿苋〔6～9〕。马齿苋含有多种营养成分钙、铁、苹果酸、二羟乙胺、葡萄糖、磷以及丰富的维生素C、胡萝卜素、维生素E、维生素B等对人体有益处的营养物质〔10～12〕。

PT表示的是动物组织里面血浆中凝血因子活性程度，TT表示动物组织里面的抗凝物质的状态，TT的延长与纤溶蛋白溶解系统功能的亢进等因素有关，APTT表示内源凝血的基本情况，特别是内源凝血最初过程中的凝血因子综合活性情况〔13～15〕，Fib表示的是动物组织里面有凝血功能的蛋白质，Fib含量升高，说明大鼠的血液中始终处于一种高凝状态，可以造成血流速度减缓，从而增加血液黏滞性；这些指标的升高表明大鼠的凝血功能存在障碍，与组织病理切片结果综合考虑，马齿苋炒炭品改善大鼠的出血情况优于马齿苋。

RBC为机体中含量最多的一类细胞，HGB能够在RBC内进行传送氧气，是蛋白质中的一种特殊物质，HCT是在一定量的容积中RBC占有的百分含量，这三种指标的升高，显示大鼠的血液流变性功能受到了限制。本试验采取灌胃与皮下注射结合的方法顺利地构建了血热出血模型，马齿苋显著降低RBC、HCT、HGB、MPV含量，改善了血液流变性，证实马齿苋存在“凉血”作用；马齿苋炭具有特异抑制血热出血模型大鼠的凝血功效及抑制大鼠肺和胃的出血作用，其效果强于生品的马齿苋。本研究进一步说明马齿苋凉血作用强，止血作用稍弱；马齿苋炒炭后止血作用增强，虽保留一定的凉血作用，但效果不及马齿苋生品好。

马齿苋性味酸、寒，炒制后凉血作用减弱，说明马齿苋可以通过炒制缓和其本身的寒凉之性，达到了调整药物治疗效果的目的，为中药炮制的“炒以缓其性”提供依据。

综上所述，马齿苋炒炭前后可以不同程度地改善大鼠出血情况，马齿苋凉血作用优于马齿苋炭，马齿苋炭止血作用优于马齿苋。