高原低氧对小鼠体内丙戊酸钠脑血分布的影响

胡 琳，赵安鹏,秦宁宁，马江红，申亦可，谢 华, 李文斌，王 荣,

(1. 兰州大学药学院, 甘肃 兰州 730000；2.联勤保障部队第九四〇医院药剂科, 甘肃 兰州 730050)

丙戊酸钠是目前癫痫治疗的一线推荐药物，对各种类型癫痫有效，应用广泛，但是其治疗窗窄，近期发现对血液系统和中枢神经系统有一些不良反应，例如高血氨症和认知功能障碍等[1]。临床上通过治疗药物监测寻找最佳用药剂量，使患者的血药浓度处于治疗窗内，从而间接控制药物入靶器官即大脑的药物浓度。中枢神经药物需通过血脑屏障进入脑组织发挥药效。狭义的血脑屏障 (blood brain barrier，BBB)[2]是指将中枢神经系统和外周循环系统分开的由微血管内皮细胞、星形胶质细胞、基底膜以及与附在内皮细胞的周细胞和神经元组成多细胞血管结构，它通过调节外周与中枢神经系统之间的分子交换来维持中枢神经系统的动态平衡。当血脑屏障对药物的通透性发生改变时，治疗药物监测获得的血药浓度则可能无法正确反映脑内药物浓度，对药物治疗的安全性、有效性带来潜在的危害[3]。Dagan等[4]研究表明，简单地使用血药浓度作为中枢神经系统中药物浓度的替代标志物可能会导致剂量不足。药物透过血脑屏障的程度除取决于药物自身的性质外，血脑屏障完整程度及血脑屏障中药物转运蛋白的含量与功能也是重要的因素[5]。课题组前期研究表明，高原低氧会不同程度改变血脑屏障中药物转运蛋白的表达[6-7]。丙戊酸钠作为BBB中药物转运外排泵P-gp的底物[8]，在高原低氧环境下，其血脑透过率是否会发生改变？本研究对高原低氧环境下丙戊酸钠的血药浓度及入脑丙药物浓度进行分析，并研究缺氧对血脑屏障上药物转运蛋白P-gp表达的影响，旨为高原丙戊酸钠合理用药提供依据。

1 材料

1.1 主要药品与试剂丙戊酸钠对照品(批号100963-202004)、替米沙坦对照品(批号100629-200401)和丙戊酸钠(批号Y18J7C16394)分别购自中国食品药品检定研究院和上海源叶生物技术有限公司；色谱纯乙腈(批号JA107230)购自德国MERCK公司；乙酸铵(批号H2110077)、伊文斯蓝(批号1922129)购自aladdin；葡聚糖(70 ku，批号C1755925)购自Merck millipore；细胞滤网(40 μm、100 μm)购自biosharp；山羊抗兔IgG-HRP二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；Anti-P Glycoprotein antibody (ab170904)和Anti-Atp1a1 antibody (ab76020) 购自美国Abcam公司。

1.2 主要仪器UFLC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；API3200三重四级杆串联质谱仪(美国应用生物系统公司)；Spectra Max i3酶标仪(美国Molecula公司)；蛋白免疫印迹电泳仪(美国Bio-Rad)；Chemi DOCTMMP Imaging System(美国BIO-RAD公司)等。

1.3 实验动物♂昆明小鼠，SPF级，体质量18～22 g，由斯贝福生物技术有限公司提供，实验动物许可证：SCXK(京)2019-0010。动物实验经兰州联勤保障部队第九四〇医院伦理委员会批准且实验均按照相关指导原则和规定进行，审批编号：2021KYLL190。

2 方法

2.1 动物分组及急进方式将♂昆明小鼠随机分为对照组(甘肃兰州，海拔1 500 m)和高原低氧组(青海玉树巴塘，海拔4 010 m)。对照组小鼠(分为P1、 P2、P3、P4，共4组)在兰州禁食12 h后开始实验；高原低氧组小鼠(分为H1、H2、H3、H4，共4组)航空及公路托运至青海玉树巴塘，禁食12 h后开始实验。其中P1、H1组用于灌胃给药，P2、H2组用于静脉注射给药，P3、H3组提取血脑屏障，P4组、H4组用于评价血脑屏障通透性。

2.2 样品收集P1组和H1组小鼠(每组36只)灌胃给予 (i.g.) 136.5 mg·kg-1的丙戊酸钠(小鼠给药剂量由人体给药剂量15 mg·kg-1通过体表面积换算获得)，并于给药第5、10、30、60、120、240 min时分别取6只小鼠取血，两组共72只；P2组和H2组小鼠(每组60只)尾静脉注射 (i.v.) 相同剂量的丙戊酸钠，给药后第2、5、30、60、120、240 min时分别取10只小鼠取血，两组共120只，1 000×g离心5 min，取上层血浆-80 ℃保存。上述小鼠取血后立即处死，取大脑并用生理盐水洗净，-80℃保存。

2.3 色谱质谱条件Gemini C18 (3.0 mm×75 mm, 3.0 μm)色谱柱，流动相为乙腈-2 mmol·L-1乙酸铵溶液 (85 ∶15,V/V)；柱温：25 ℃，流速：0.4 mL·min-1，进样量：2 μL，分析时间为3 min。在ESI源负离子电离方式下，采用多反应监测模式 (MRM)有较好的质谱响应，质谱参数设置如下：喷雾电压 (IS)为-4 500 V，雾化温度 (TEM)为400 ℃，丙戊酸钠和替米沙坦碰撞诱导解离电压 (DP)分别为-30 psi、-15 psi，碰撞能量 (CE)为-5 psi、-19 psi。丙戊酸钠、替米沙坦检测离子分别为m/z 142.6→142.6、m/z 513.2→469.2。

2.4 生物样品处理方法准确吸取血浆样品10 μL置于0.5 mL的EP管中，加入40 μL大鼠空白血浆，再加入200 μL的5 mg·L-1内标溶液，涡旋震荡30 s，4 500×g离心10 min后取上清于进样瓶中，进样量2 μL。取备用脑组织，称取0.1 g脑皮层于2 mL的EP管中，加1.0 mL生理盐水匀浆，取25 μL匀浆液再加入175 μL的5 mg·L-1内标对照品工作溶液，涡旋震荡30 s，4 500×g离心10 min后取上清液进样。

2.5 血脑屏障提取P3组和H3组(每组10只)小鼠处死后，立即取出大脑。大脑在冰冷的Hank’s溶液中剥去软脑膜，再去除大血管和髓质。剩余组织在Hank’s溶液使用玻璃匀浆器上下匀浆6次，匀浆液于1 000×g离心10 min。沉淀重悬于15 mL 18%葡聚糖中，然后在4 500×g离心15 min。沉淀重悬于Hank’s溶液，悬浮液先后用100 μm细胞滤网和40 μm细胞滤网过滤。随后用含有2%蛋白酶抑制剂的Hank’s溶液收集滤网上的脑微血管，4 500×g离心15 min后收集的沉淀即为脑微血管[9]。采用膜提取试剂盒提取脑微血管的膜蛋白，BCA试剂盒测定蛋白总量。

2.6 血脑屏障通透性评价P4组和H4组小鼠(每组6只)尾静脉注射 (i.v.)2%伊文斯蓝溶液 (2 mL·kg-1),循环45 min后迅速取出全脑用滤纸吸净。右半球脑组织在3 mL甲酰胺中剪碎后，60 ℃水浴孵育24 h，4 500×g离心5 min。在610 nm处，测量伊文思蓝含量。并根据标准曲线定量，结果表示为(μg伊文思蓝染色)/(g组织)。

2.7 P-gp蛋白的定量通过7%SDS-PAGE分离蛋白样品，并在恒定电压80 V下转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗anti-P-gp antibody, anti-ATP1a1 antibody 4 ℃过夜孵育。随后用TBST洗4次后，室温孵育二抗后，PVDF膜用TBST洗4次后，进行曝光。

2.8 数据处理脑/血药物浓度比值=脑组织药物浓度(μg·g-1) /血浆药物浓度(mg·L-1)，即K(brain/plasma)=C (brain)/C (plasma)[10]；曝光图片通过ImageJ软件分析目的蛋白表达量。实验结果采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析。

3 结果

3.1 方法验证

3.1.1专属性 取空白血浆、空白脑组织、空白血浆加丙戊酸钠、空白脑组织加丙戊酸钠及给药后的小鼠生物样品，按照“1.4.2”方法处理进样,丙戊酸及内标替米沙坦的典型色谱图见Fig 1，从图可知该方法对丙戊酸钠和内标替米沙坦的专属性良好，脑组织及血浆中内源性物质不干扰色谱分析，满足定量要求。

Fig 1 Chromatograms of sodium valproate in biological samplesA，B: Blank plasma and blank brain, C，D: Blank plasma and blank brain spiked with standard sodium valproate, E-F: Sample of plasma and brain, Blue: Sodium valproate; Red: IS.

3.1.2线性范围 丙戊酸在血浆和脑组织中线性范围为0.05～100 mg·L-1，得到的线性回归方程为:Y=0.001 51X+4.49(r=0.997 4)；Y=0.013 1X+0.598 6(r=0.999 6)，结果表明待测物在设定浓度范围内具有良好的线性。

3.1.3精密度与准确度 结果见Tab 1，丙戊酸钠的日内和日间精密度和准确度均满足生物样品测定要求。

Tab 1 Accuracy and precision of sodium

3.1.4基质效应和提取回收率 丙戊酸钠满足定量要求，并且不存在明显的生物样品基质效应。

3.1.5稳定性 丙戊酸钠生物样品在4 ℃保存24 h、3次反复冻融、-80 ℃保存一个月的稳定性。结果表明：在不同条件处理后，丙戊酸钠生物样品中浓度变化≤8.87%，表明具有良好的稳定性。

3.2 生物样品中药物浓度的测定结果

3.2.1灌胃给药的样品药物浓度 小鼠灌胃给药丙戊酸钠后，第5、10、30、60、120、240 min时血浆及脑组织中丙戊酸钠分布见Fig 2。与对照组相比，给药第30、60 min时高原组血药浓度分别降低了35.77%、33.7%；高原组脑组织中药物浓度高于对照组，其中给药第60、120 min时高原脑组织药物浓度分别升高了148.3%、172.0%；高原组脑/血药物浓度比值在第10、30、60、120 min时分别增加44.0%、57.9%、176.8%、184.5%。

Fig 2 Concentrations and brain/plasma ratio of 136.5 mg·kg-1 sodium valproate in mice by intragastric administration(n=6)A: Plasma, B: Brain,C: Brain/blood ratio *P<0.05,**P<0.01 vs P1

3.2.2尾静脉注射给药的样品药物浓度 小鼠尾静脉注射丙戊酸钠第2、5、30、60、120、240 min时，血浆及脑组织中丙戊酸钠药物浓度见下Fig 3。由图可知，与对照组相比，当血药浓度值相差不大时，高原组脑皮层中药物浓度在各个时间点均高于对照组，且在第60 min时浓度增大27.4%，在第120 min时增大62.4%，在第240 min时增大45.8%。与对照组相比，高原组脑/血药物浓度比值在第60、120、240 min时分别增加了33.9%、50.6%、125.6%。

Fig 3 Concentrations and brain/plasma ratio of 136.5 mg·kg-1 sodium valproate in mice injected intravenously administration(n=6)A: Plasma, B: Brain,C: Brain/plasma ratio *P<0.05,**P<0.01 vs P2

3.3 血脑屏障完整性评价对照组与高原组小鼠脑组织中伊文斯蓝含量分别 (3.65±0.88) μg·g-1和 (3.67±0.76) μg·g-1，差异无统计学意义(P>0.05)，表明血脑屏障的完整性无明显改变。

3.4 高原低氧对小鼠血脑屏障中P-gp表达的影响通过Western blot对脑微血管段中ABC族药物转运蛋白P-gp进行定量，在分子量为170 ku处检测到特异性条带。如Fig 4，与对照组相比，高原组P-gp蛋白相对表达量明显下降了58.5% (P<0.05)。

Fig 4 Influence of altitude hypoxia environment (4010 m ) on P-gp protein expression level in blood brain barrier *P<0.05 vs P3

4 讨论

癫痫患者不能被彻底治愈，需终身用药。研究发现长期或高剂量服用丙戊酸钠的患者会发生一系列不良反应，例如神经毒性[1]。高原低氧环境会不同程度改变血脑屏障中药物转运蛋白的表达，所以研究高原低氧对丙戊酸钠入脑的影响十分必要。本研究通过灌胃和注射两种给药方式研究高原低氧对丙戊酸钠的血脑屏障透过率的影响。结果表明，丙戊酸在高原组的血脑屏障透过率均高于对照组。除药物自身性质外，血脑屏障完整程度及血脑屏障中药物转运蛋白的含量与功能也是影响药物血脑屏障透过率的重要因素。

在研究高原低氧对丙戊酸钠脑组织分布影响之前，我们首先使用伊文斯蓝对血脑屏障进行完整性评价。伊文斯蓝可与白蛋白(血浆中分子量最小的蛋白之一)形成复合体，若血脑屏障完整性受到破坏，复合体会迁移到脑组织中。根据脑组织中伊文斯蓝的含量可判断血脑屏障的完整性。伊文斯蓝结果表明，高原组与对照组脑内伊文思蓝含量无显著性差异，表明本研究所采用的高原低氧条件对小鼠的血脑屏障完整性无明显影响，这与前期课题组结果相同[11]。许多耐药性癫痫患者对多种抗癫痫药表现出耐药性，这些患者血药浓度在有效范围值内时，却没有达到抗癫痫效果[12]，研究发现这可能是由于脑区域中P-gp和其他外排转运体高表达的原因。P-糖蛋白 (P-gp)是一种外排转运蛋白，在小鼠脑微血管管腔表面表达，其可将进入血管内皮细胞的部分底物药物再次排向血液(即管腔侧)，从而减少药物向脑组织的分布，研究表明减少BBB处P-gp的表达或抑制其功能会导致脑内药物浓度增加[13]。大多数抗癫痫药是P-gp的底物。通过对所提取的小鼠脑微血管的P-gp进行定量发现，高原低氧环境下小鼠脑微血管的P-gp表达量下降，这可能是高原组丙戊酸钠脑血透过率高于对照组的原因。因为P-gp是外排转运蛋白，其低表达量可能会使脑内丙戊酸钠外排减少。

总之，本研究发现高原低氧环境增加了丙戊酸在小鼠血脑屏障上的透过程度，从而改变了丙戊酸在小鼠体内的脑血分布，这可能与高原低氧环境下调了小鼠脑微血管上P-gp的表达量有关，这为高原癫痫患者合理用药提供依据。