饲粮中添加不同组合的酸化剂对肉鸡肠道微生物菌群、肠道形态以及胃蛋白酶活性的影响

刘新泽 胡友军 赵晓南 张瑞阳 朱宇旌 张 勇 李方方**

(1.沈阳农业大学动物科学与医学学院，沈阳 110866；2.广东酸动力生物科技有限公司，清远 511500)

我国是畜禽养殖大国，同时也是兽用抗菌类药物生产和使用大国。抗菌类药物在动物疾病防治、提高生产效益、保证畜禽产品安全方面上发挥了重要的作用，伴随着生产中的大量使用，更引发了一系列公共卫生问题[1-2]。寻找抗生素有效替代产品尤为关键，目前常用的饲用抗生素替代物有益生菌、抗菌肽、植物提取物、酸化剂、寡糖、酶制剂等[3]。酸化剂作为其中一种新型的绿色添加剂在生产中得到了越来越多的应用。酸化剂是指提高饲料酸度，动物采食以后降低消化道的pH，促进胃内酶原活化和营养物质的消化，尤其是蛋白质的吸收，改善胃肠道微生物区系平衡，抑制有害微生物的繁殖，从而达到防病促生长的目的[4-5]。研究表明，饲粮中添加甲酸可显著提高肉鸡生长性能、免疫性能以及改善肠道健康[6]。Khan等[7]报道，饲粮中添加0.3%甲酸铵可提高21日龄肉鸡平均日增重。研究表明，植物精油具有提高肉鸡生长性能、免疫性能、抗氧化能力、改善肠道菌群以及肉品质等作用，目前植物精油的研究主要集中在生长性能和免疫性能等方面[8]。徐青青[9]和刘柏松等[10]研究表明，在饮水或者饲粮中添加酸化剂可改善肉鸡的生长性能及肠道健康状况[9-10]。因此，本试验旨在研究不同组合的酸化剂对肉鸡肠道微生物菌群、肠道形态以及胃蛋白酶活性的影响，为改善肉鸡胃肠道环境和消化功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用酸化剂由某生物科技有限公司提供，甲酸甲酸铵复合酸化剂主要成分为甲酸、甲酸铵，有效成分含量≥60%；缓释甲酸主要成分为甲酸，有效成分含量≥40%，精油主要成分为桉叶素、肉桂醛、香芹酚，有效成分含量≥40%。

1.2 试验设计

试验采用单因素完全随机设计，将1 080只肉鸡随机分为9组，每组6个重复，每个重复20只鸡，试验设计见表1。

表1 试验设计

1.3 试验动物及饲养管理

试验在辽宁春天养殖场进行，选取体况良好的7日龄爱拔益加(AA)肉鸡1 080只，初始体重差异不显著(P>0.05)的前提下，将肉鸡按性别和平均体重一致性原则随机分配到9组中，试验期42 d。饲养试验在同一栋鸡舍内进行，温度和湿度适宜，并保持良好的通风。按常规的管理和免疫接种程序进行饲养。试验期间，肉鸡自由采食，充足饮水。

1.4 试验饲粮

基础饲粮为参照NRC(2012)营养需要配制的玉米-豆粕型颗粒配合饲料，基础饲粮组成及营养水平见表2。

表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.5 指标测定与方法

1.5.1 肠道形态与肠道微生物菌群

试验结束时，从每个重复中随机挑选2只体况健康且体重相近的肉鸡，屠宰前正常饲喂，屠宰后收集回肠和盲肠食糜于冻存管中，标记投入液氮中速冻，迅速转移至-80 ℃超低温冰箱中待测，测试前需要将样品从-80 ℃超低温冰箱中转移至4 ℃冰箱中解冻，并测定微生物总数以及乳酸菌、大肠杆菌数量。具体操作步骤参照孙建华等[11]肠道微生物的测定方法。

剪切3～5 cm的回肠和空肠肠段，使用0.9%生理盐水缓慢冲洗肠道内容物，尽量不要力度过大，以免损坏肠道形态，小心将其放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，进行常规石蜡脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片与烤片、切片脱蜡与水化，用苏木精-伊红(HE)染色法进行染色，在倒置荧光显微镜(OLYMPUS CKX53，日本)下观察拍照，使用IPP 6.0软件对图像进行绒毛高度和隐窝深度测量，并计算绒隐比(绒毛高度与隐窝深度的比值，V/C)。

1.5.2 胃食糜pH和蛋白酶活性

肉鸡屠宰后，取肌胃和腺胃食糜装入冻存管中，标记后放入液氮中速冻，立即转入-20 ℃保存，避免反复冻融。利用酸度计测定肌胃和腺胃食糜的pH变化，利用双抗体夹心法测定肌胃和腺胃食糜的蛋白酶活性。使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD)值，通过标准曲线计算蛋白酶活性，试剂盒购于江苏宝莱生物科技有限公司，按试剂盒说明书进行操作。

1.6 数据处理及分析

采用Excel 2010对数据进行初步整理，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，当差异显著时采用Duncan氏法进行多重比较。P<0.05表示差异显著，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结 果

2.1 不同组合的酸化剂对肉鸡肠道微生物菌群的影响

2.1.1 不同组合的酸化剂对肉鸡回肠微生物菌群的影响

由表3可知，与对照组相比，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的回肠大肠杆菌数量显著降低(P<0.05)，分别降低了19.28%、15.51%、14.93%；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的回肠乳酸杆菌数量显著提高(P<0.05)，分别提高了25.44%、18.68%、16.62%。Ⅴ组的回肠微生物总数显著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ组(P<0.05)。

表3 不同组合的酸化剂对肉鸡回肠微生物菌群的影响

2.1.2 不同组合的酸化剂对肉鸡盲肠微生物菌群的影响

由表4可知，各组之间盲肠大肠杆菌和乳酸杆菌数量无显著差异(P>0.05)。Ⅴ组的盲肠微生物总数显著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ组(P<0.05)，分别降低了47.72%、29.12%、32.14%、36.18%。

表4 不同组合的酸化剂对肉鸡盲肠微生物菌群的影响

2.2 不同组合的酸化剂对肉鸡肠道形态的影响

2.2.1 不同组合的酸化剂对肉鸡空肠形态的影响

由表5和图1可知，与对照组相比，Ⅲ组的空肠绒毛高度显著提高(P<0.05)，提高了15.87%；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组的空肠隐窝深度显著降低(P<0.05)，分别降低了32.87%、19.04%、24.66%、20.63%；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的空肠绒隐比显著提高(P<0.05)，分别显著提高了26.24%、40.68%、23.00%。

表5 不同组合的酸化剂对肉鸡空肠形态的影响

图1 各组空肠切片

2.2.2 不同组合的酸化剂对肉鸡回肠形态的影响

由表6和图2可知，与对照组相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ组的回肠绒毛高度显著提高(P<0.05)，分别提高了35.29%、23.68%、34.06%、12.82%、15.80%、62.15%。Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ组的回肠绒隐比显著高于Ⅲ组(P<0.05)。

表6 不同组合的酸化剂对肉鸡回肠形态的影响

图2 各组回肠切片

2.3 不同组合的酸化剂对肉鸡胃食糜pH和胃蛋白酶活性的影响

由表7可知，与对照组相比，其他各组肌胃和腺胃食糜pH均显著降低(P<0.05)；Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ组腺胃食糜胃蛋白酶活性显著提高(P<0.05)，分别提高了5.23%、2.91%、11.75%；Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ组肌胃食糜胃蛋白酶活性显著提高(P<0.05)，分别提高了4.38%、16.42%、4.18%。

表7 不同组合的酸化剂对肉鸡胃食糜pH和蛋白酶活性的影响

3 讨 论

3.1 不同组合的酸化剂对肉鸡肠道微生物菌群的影响

家禽的肠道内生存着500多种微生物，主要以有益微生物为主，这些有益微生物能够维持肠道健康、杀灭有害菌[12]。正常情况下，有益微生物数量和有害微生物数量保持在一个平衡的状态，当有益微生物数量占有优势时，有益微生物能够利用寡糖发酵产生短链脂肪酸，动物肠道内的pH降低，大肠杆菌和沙门氏菌的增长便得到了抑制，肠道内环境得到保护，畜禽机体实现健康生长；当有害微生物数量占有优势时，会抑制畜禽机体生长，引发疾病[13-14]。孙建华等[11]研究表明，饮水中添加酸化剂促进了肉鸡空肠和回肠中乳酸杆菌生长，抑制了空肠和回肠中大肠杆菌繁殖。范觉鑫等[15]研究表明，肉鸡饲粮中添加3 kg/t的复合酸化剂显著增加了盲肠乳酸杆菌数量。罗四维[16]研究表明，复合酸化剂降低了肉鸡盲肠和空肠大肠杆菌数量。郭志有等[17]研究表明，饲粮和饮水中添加酸化剂可以降低肉鸡盲肠大肠杆菌数量，增加盲肠乳酸杆菌数量。本试验的研究结果与孙建华等[11]、范觉鑫等[15]、罗四维[16]、郭志有等[17]研究结果基本一致。本试验中，饲粮中添加0.1%(甲酸甲酸铵+精油)复合酸化剂可以有效地降低肉鸡盲肠和回肠大肠杆菌数量以及回肠微生物总数，提高盲肠和回肠乳酸杆菌数量。

3.2 不同组合的酸化剂对肉鸡肠道形态的影响

肠道属于动物营养物质消化吸收的重要场所之一，营养物质进入动物体内经过物理反应过程最终被小肠上皮细胞吸收，动物的消化吸能力可以通过肠道黏膜的发育情况得以反映。由于小肠绒毛的特殊结构所以更利于营养物质的吸收。当小肠绒毛高度增加时，同时也增加了它与消化道内容物的接触面接，使其加强了对营养物质的消化吸收。小肠绒毛根部上皮下陷至固有层形成的管状腺体叫做小肠隐窝，由于隐窝底部的上皮细胞不断地向上分化新的绒毛，所以隐窝深度在一定的程度上可以反映小肠绒毛的更新速度[18]。罗四维[16]研究表明，饲粮添加复合酸化剂可以提高了肉鸡21日龄十二指肠和空肠以及42日龄空肠的绒毛高度，降低了21日龄十二指肠的隐窝深度。瞿蕾[19]研究表明，饲粮中添加复合酸化剂可以显著增加肉鸡肠道绒毛高度，但对隐窝深度无显著影响。王淑琴[20]研究表明，饲粮中添加0.75%的柠檬酸一定程度上增加了肉鸡小肠绒毛高度，降低了十二指肠隐窝深度；饲粮中添加1.50%的柠檬酸增加了肉鸡回肠的绒毛高度和隐窝深度，降低了十二指肠和空肠绒毛高度和隐窝深度。本试验结果与罗四维[16]研究结果有一定相似之处；而王淑琴[20]研究为单一柠檬酸，采用的酸化剂与本文试验采用酸化剂有较大差别，酸化剂的类型不同可能会导致结果的差异。本试验中，饲粮中添加0.2%甲酸甲酸铵复合酸化剂能有效地降低肉鸡空肠绒毛高度，提高空肠绒隐比和回肠绒毛高度，饲粮中添加0.1%(甲酸甲酸铵+精油)复合酸化剂能有效地降低空肠隐窝深度，提高空肠绒隐比。

3.3 不同组合的酸化剂对肉鸡胃食糜pH和蛋白酶活性的影响

酸化剂可有效降低消化道pH，李连缺等[21]研究表明，饲粮中添加0.2%柠檬酸和0.2%复合酸能显著降低饲粮pH，0.2%复合酸组44周龄蛋鸡嗉囊、腺胃pH极显著低于0.2%柠檬酸组和基础饲粮组，0.2%复合酸组48周龄蛋鸡嗉囊、腺胃pH显著低于0.2%柠檬酸组和基础饲粮组，表明酸化剂可降低饲粮pH，改善老龄蛋鸡消化道内环境，且复合酸的效果优于柠檬酸。本研究结果同样表明饲粮中添加不同组合的酸化剂均显著降低肌胃和腺胃食糜pH。有研究表明，肉鸡腺胃分泌的消化液中不仅含有胃蛋白酶和盐酸，还含有胃蛋白酶原。胃蛋白酶原是非活性的初级蛋白酶原，其活化成胃蛋白酶的适宜pH为2.0～3.5，当pH大于6.0时，胃蛋白酶失活[22]；腺胃分泌胃液，但是腺胃体积较小，食物在腺胃停留时间较短，所以肌胃是胃液消化作用的主要场所[23]。郭鹏等[24]研究表明，饲粮中添加复合酸化剂能够降低21日龄肉鸡腺胃和肌胃的胃蛋白酶活性，但差异不显著。冷向军等[25]研究表明，饲粮中添加0.25%复合酸可以刺激胃蛋白酶分泌，而添加1.5%柠檬酸和0.6%盐酸无显著效果；饲粮中添加2.4%的盐酸严重导致了胃蛋白酶分泌降低。本试验中，饲粮中添加0.1%和0.2%(甲酸甲酸铵+精油)复合酸化剂的腺胃蛋白酶活性结果和添加0.2%缓释甲酸、0.1%(缓释甲酸+精油)复合酸化剂的肌胃蛋白酶活性结果与郭鹏等[24]和冷向军等[25]的研究结果相似。肖芹等[26]研究表明，饲粮中添加不同水平的磷酸可显著影响42日龄肉鸡腺胃和肌胃的胃蛋白酶活性。本试验研究结果与肖芹等[26]研究结果相似。综合本试验结果来看，饲粮中添加0.2%(缓释甲酸+精油)复合酸化剂可以有效地降低肉鸡肌胃和腺胃食糜pH，从而提高腺胃和肌胃的蛋白酶活性，并提高蛋白质的消化率。

4 结 论

饲粮中添加0.1%(甲酸甲酸铵+精油)复合酸化剂提高了肉鸡回肠乳酸杆菌数量、空肠绒隐比和胃蛋白酶活性，降低了空肠隐窝深度和回肠大肠杆菌数量。本试验条件下，推荐在肉鸡饲粮中添加0.1%(甲酸甲酸铵+精油)复合酸化剂。