丹参多倍体开花前后丹酚酸生物合成关键酶活性的变化

吴 顺，马晓静，邱 云，孙健鹏，翟 茜，刘 奇

（中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙 410018）

0 引言

丹参(Salvia miltiorrhiza)属唇形科鼠尾草属，以根入药，主要有效成分为脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹参酚酸类，在临床上可用于心脑血管疾病、癌症及各种炎症的治疗[1-4]，被公认为是经济效益好、药用价值高的重要中药之一[5-6]。由于中药市场近年来对丹参的需求量越来越大，但其质量却远未达到市场要求，提高丹参中生物活性成分含量已成为研究的重要目标[7-8]。鉴于传统中药以水煎服的用药方式，丹参水溶性成分逐渐成为近年来研究的热点[9]。

药材品质除与品种、产地等有关外，其主要有效成分也会随其生长发育期的变化而发生变化[10-11]。次生代谢物质是植物天然产物的主要组成部分，也是轻化产品、医药生产的重要物质基础。然而，次生代谢物质的产生是在初级代谢中间产物积累的基础上，经过一系列酶催化后才会形成。现有研究表明，丹参酚酸类化合物是在苯丙烷和酪氨酸2条代谢途径共同作用下进行生物合成的，其中，产生的迷迭香酸是丹酚酸B的核心前体[12]，而酪氨酸氨基转移酶(TAT)作用催化酪氨酸生成4-羟基苯乳酸是合成迷迭香酸的重要步骤，因而被称为迷迭香酸合成途径中的限速酶。苯丙氨酸裂解酶(PAL)作为苯丙烷代谢途径中的关键酶，可催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，进而由肉桂酸-4-羟化酶(C4H)催化形成4-香豆酸[13-18]。因此，探讨这些关键酶活性的变化对于丹参酚酸含量的调控具有重要参考价值。

丹参作为一年生开花植物，在花序发育过程中代谢活动会发生明显变化，需要消耗大量的营养物质，使叶片加速衰老，进而引起相关酶活性变化。目前，对丹参花期生理特性的研究鲜见报道。笔者比较丹参多倍体开花前后丹参酚酸关键酶活性的变化，旨在探讨有效成分中间物质与开花的关系，为进一步调控丹参开花提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2019年2月在中南林业科技大学校内实验基地进行。

1.2 试验材料

前期采用秋水仙碱诱导获得紫花丹参四倍体，由于同源多倍化后诱发丹参基因组结构变异（相关结果待发表），经筛选得到了一系列变异突变体（分别标记为2～7号，1为紫花丹参二倍体）种植于中南林业科技大学试验基地，分别在不同时期采集相同部位的健康叶片。

1.3 试验方法

1.3.1 材料采集 在丹参出现花蕾但还未露出花瓣（花蕾期）、开花盛期（盛花期）、花完全凋谢后（衰败期）分别从丹参带花蕾茎上部采集健康叶片若干，备用。

1.3.2 可溶性蛋白含量的测定 参照文献[19]进行测定。

1.3.3 酶活性的测定 材料用蒸馏水冲洗3次，擦干水分，按试验需要称重后用液氮处理，并保存于-80℃冰箱。TAT和PAL酶活性参照文献[20]，C4H酶活性采用肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)检测试剂盒（比色法）。

1.4 数据分析

所获得数据利用Excel 2016软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 可溶性蛋白质含量

丹参开花前后叶片中可溶性蛋白含量如图1所示。随着花期的进行，其可溶性蛋白含量先升后降，在盛花期达到峰值，这可能与丹参开花过程中表达大量开花相关蛋白有关。就不同丹参多倍体来看，5号丹参不同时期叶片内可溶性蛋白含量都较其他高，前期研究[21]发现其根内丹酚酸B含量也较其他丹参高，这可能暗示5号丹参叶片内合成的丹参酚酸前体能较多地运往其根内，并转变为最终产物。

图1 丹参开花前后可溶性蛋白含量的变化

2.2 TAT活性

丹参开花前后叶片中TAT活性如图2所示。不同丹参在花蕾期TAT酶活性都比开花后高，尤其是在盛花期时酶活性明显降低，表明开花前期的生长可能有利于丹参根内丹参酚酸类物质前体的合成，而开花后相关前体合成减少，不利于丹参酚酸类物质的积累。不同丹参多倍体TAT酶活性也表现不同。其中，5号在开花前后TAT酶活性均较高，推测其在整个生长发育期间能合成较多的迷迭香酸前体，进而合成更多的丹酚酸B。

图2 丹参开花前后TAT酶活性的变化

2.3 PAL活性

丹参开花前后叶片中PAL活性如图3所示。所有丹参多倍体叶片中PAL酶活性基本呈逐渐上升趋势，但5号丹参叶片中PAL酶活性在各时期都比其他丹参多倍体高，这也可能是5号丹参根内丹参酚酸含量较其他丹参高的原因之一。

图3 丹参开花前后PAL活性的变化

2.4 C4H活性

丹参开花前后叶片中C4H活性如图4所示。不同丹参多倍体叶片中C4H酶活性变化随着花期的进行先降低后升高，盛花期C4H酶活性降低可能与过多蛋白参与开花过程有关，同时由于大量酶底物被消耗也会降低酶活性。当然，不同丹参多倍体的C4H酶活性在同一时期也表现不同，其中5号丹参在花期C4H活性较其他丹参高且变化幅度也较其他丹参小，这可能也与它能稳定地向根内运输相关前体，从而较多合成丹参酚酸类物质有关。

图4 丹参开花前后C4H活性的变化

3 结论

叶片光合产物是丹参初级代谢产物和次级代谢产物中间体的主要来源。从研究结果看，不同丹参多倍体叶片内可溶性蛋白含量与其根内丹酚酸含量在一定程度上具有较大相关性，表明根内酚酸类物质的合成可能与叶内合成的相关前体运输有关。

丹参开花前后叶片内相关酶活性会发生明显变化。就丹酚酸合成相关酶TAT、PAL、C4H来看，基本都表现出开花前酶活性较高，盛花期下降，而花后又逐渐上升的趋势，表明开花对丹参次生代谢物质的形成具有较大影响。就不同丹参多倍体来看，根内丹酚酸含量的高低，与其叶内相关酶活性高有关。这些研究结果的获得，为今后进一步对丹参花期进行调控提供了理论依据。

4 讨论

丹参是一年生开花植物，其生长发育过程可分为开花前的营养生长和开花后的生殖生长，前期营养生长的物质积累是后期花器官形成和开花的基础，然而开花也需要消耗大量营养，反过来又会影响丹参的生长过程，进而影响相关酶活性及其物质积累过程[22-23]。

丹酚酸类物质是丹参中主要次生代谢产物之一，其含量是在大量初级代谢中间产物积累基础上通过相关生物合成酶类作用下形成的[24-25]。丹酚酸类物质含量除受环境因素影响外，还与本身所处的生长发育时期密切相关，尤其是生殖生长时期对物质积累影响更为明显。在丹参开花前，丹参生长速度较快，代谢活动旺盛，酶活性较高，次生代谢的中间产物不断增加，有利于丹酚酸类物质的积累。而进入开花后，代谢活动减弱，体内贮存物质发生转变，大量营养物质被消耗，用于次生代谢物质的合成底物减少，酶活性降低。

根据丹参花的不同，目前有紫花丹参、白花丹参和无花丹参，相较于其他2种丹参，无花丹参中有效成分是最高的[26]，可能开花对丹参中有效成分的积累具有较大影响。因此，在丹参生长发育时尽量延缓花期或控制其开花具有提升有效成分积累的可能。本研究发现，5号多倍体丹参丹酚酸含量较高且整个花期相关酶活性也保持较高活性，表明其遗传上相较于其他多倍体发生改变，因此，需要从遗传和生理特性上对丹参进行深入研究，为进一步通过调控其代谢途径提高有效成分含量和选育丹参优良品种提供重要依据。