miR-802、TNF-α在妊娠期糖尿病患者血清和胎盘组织中的表达及意义*

张瑶, 魏若菡

台州市第一人民医院(温州医科大学附属黄岩医院)妇产科(浙江台州 318020)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是在女性妊娠期首次发现/发生的一种糖耐量异常疾病，其可使围产期母婴并发症的风险升高，而胰岛细胞功能受损、胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)是GDM患者普遍具有的生理病理特点[1-2]。有研究认为，GDM发病与微小RNA(microRNA, miRNA)表达失调、IR、炎症反应、糖脂代谢异常等相关[3-4]。有关研究结果显示，微小RNA-802(microRNA-802, miR-802)可调控骨骼肌细胞对葡萄糖的转运及胰岛素的敏感性，其可能是治疗2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的潜在靶点[5]；另外，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)在GDM患者中呈高表达，与IR有关[6]；且miR-802可通过促进TNF-α分泌，进而影响炎症性肠病的发生发展[7]。因此，推测miR-802可能与GDM病理过程相关。本研究初步通过测定miR-802在GDM孕妇血清、胎盘组织中的表达水平，分析miR-802与IR、TNF-α的相关性，以期为临床诊治GDM提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年12月至2020年6月本院82例经口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test, OGTT)(24～28周)确定为GDM的孕妇为GDM组，年龄23～35岁，平均(29.22±3.95)岁；孕周38～40周，平均(39.35±0.64)周；孕前体质指数(body mass index, BMI)为18.07～24.90 kg/m2，平均BMI(21.70±2.40)kg/m2。并纳入同期82例经OGTT判定为正常糖耐量(normal glucose tolerance，NGT)的孕妇为NGT组，年龄22～35岁，平均(28.75±3.74)岁；孕周38～40周，平均(39.27±0.62)周；孕前BMI为18.15～24.82 kg/m2，平均(21.38±2.31)kg/m2。另外，收集NGT组、GDM组空腹胰岛素(fasting insulin, FINS)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、三酰甘油(triglycerides，TG)、稳态模型胰岛素抵抗指数(homeostatic model assessment insulin resistance, HOMA-IR)(HOMA-IR= FINS×FBG /22.5)等资料。

纳入标准：(1)GDM孕妇符合《2015年国际妇产科联盟(FIGO)妊娠期糖尿病诊疗指南解读》[8]有关GDM的判定标准，孕期任何时候血糖值满足下述任意一条或多条即为GDM:①FBG:5.1 ～ 6.9 mmol/L(92 ～ 125 mg/dL)；②75 g OGTT：1 h 血糖:≥10.0 mmol/L(180 mg/dL)；③2 h 血糖:8.5 ～ 11.0 mmol/L(153 ～ 199 mg/dL)；(2)受试者对本研究知情同意，且均为单胎妊娠。排除标准：(1)孕前患有糖尿病者；(2)合并高血压、肝肾功能异常、急慢性炎症、心功能不全者；(3)合并多囊卵巢综合征者；(4)服用激素类等药物或其他因素引起血糖升高者。

本研究经本院伦理委员会批准(20180145)，且其符合《赫尔辛基宣言》要求。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 血清收集：收集NGT组、GDM组孕妇空腹外周血4～5 mL，静置28～30 min，分离血清(5 000 r/min离心7 min)，置于-70℃冰箱。

胎盘组织收集：所有胎盘娩出后，迅速从胎盘母体面(距脐带附着1 cm处)剪取1 cm×1 cm×1 cm的组织(避开钙化、梗死区)，生理盐水洗3次，立即置于液氮中冻存15 min，之后置于-70℃冰箱。

1.2.2 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法检测血清、胎盘组织miR-802、TNF-α mRNA表达水平 解冻NGT组、GDM组孕妇血清、胎盘组织，利用Trizol Reagent(S30876，上海源叶生物科技有限公司)提取总RNA，使用紫外分光光度计(DU-730，美国Beckman公司)测定样本总RNA在260 nm、280 nm的吸光度值(A)，将A260/A280比值在1.8～2.0的样本RNA用于后续实验；然后，采用First Strand cDNA Synthesis Kit(YB411A，上海钰博生物科技有限公司)将样本RNA反转录为cDNA；最终，用Perfectstart SYBR Green qPCR master mix(TQ2300-01，美国OMEGA公司)、qRT-PCR仪(SLAN-96S，上海宏石医疗科技有限公司)将合成的cDNA进行扩增、检测。扩增条件：98℃预变性7 min；95℃ 30 s，62.6℃ 30 s，62℃ 10 s，40个循环。miR-802、TNF-α内参基因分别为U6、GAPDH，其相对表达量以2-ΔΔCT法计算，引物序列见表1。

表1 miR-802、TNF-α及内参U6、GAPDH的引物序列

2 结果

2.1 两组一般资料比较 GDM组FINS、TG、FBG、HOMA-IR水平高于NGT组(P<0.05)，GDM组TC水平、孕前BMI、年龄、孕周与NGT组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.2 两组血清、胎盘组织中miR-802、TNF-α mRNA表达水平比较 与NGT组相比，GDM组患者血清、胎盘组织miR-802、TNF-α mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。见表3。

表2 两组一般资料比较

表3 两组血清、胎盘组织中miR-802、TNF-α mRNA表达水平比较

2.3 GDM孕妇血清、胎盘组织miR-802、TNF-α mRNA表达水平与FINS、TG、FBG、HOMA-IR的相关性 GDM孕妇血清、胎盘组织miR-802、TNF-α mRNA表达水平与HOMA-IR均呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 GDM孕妇血清、胎盘组织miR-802、TNF-α mRNA表达水平与FINS、TG、FBG、HOMA-IR的相关性

2.4 GDM孕妇血清、胎盘组织miR-802表达水平与TNF-α mRNA的相关性 GDM孕妇血清、胎盘组织miR-802表达水平与TNF-α mRNA均呈正相关(r= 0.532、0.591，P<0.05)。见图1～2。

3 讨论

GDM发病率呈逐年升高趋势，其可引起胎膜早破、难产、巨大儿、T2DM、代谢综合征、巨大儿、心血管疾病等，对母婴安全构成威胁[9-10]。HOMA-IR是评估IR的常用指标，本研究中GDM孕妇HOMA-IR、FINS、TG、FBG水平较高，与郭碧莲等[11]、王孝君等[12]研究相符，提示GDM发生发展与IR、糖脂代谢紊乱有关。探寻与GDM发病相关的机制，对及时防治GDM、改善母婴结局有积极意义，且其也是目前研究的热点。

图1 GDM孕妇血清miR-802表达水平与TNF-α mRNA的相关性

图2 GDM孕妇胎盘组织miR-802表达水平与TNF-α mRNA的

miRNA是一类非编码RNA小分子，可稳定存在于血清、组织中，其可调控炎症反应，影响氧化应激，调节自噬，诱导血管内皮损伤，与GDM、T2DM等关系密切[13-14]。miR-802是miRNA的一员，与IR、糖代谢有关，其在T2DM患者血清中呈高表达，miR-802可作为诊断T2DM的辅助标志物[15]；另外，miR-802在肥胖中表达水平较高，其可损害胰岛素转录、分泌，促进IR，miR-802可能是T2DM的治疗靶点[16-17]。本研究中GDM孕妇血清、胎盘组织miR-802表达水平较NGT孕妇显著升高，提示miR-802可能在GDM发生发展中起调控作用，推测高表达miR-802可能通过影响胰岛素的分泌、敏感性及葡萄糖转运、IR，进而影响GDM发病过程，然而，其具体机制仍需进一步探究证实。

TNF-α是由血管内皮细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等分泌的细胞因子，其可与相应受体结合进而参与细胞增殖、IR、信号转导；TNF-α还可损伤血管内皮细胞功能，增加血管通透性，造成血管痉挛，促进免疫炎症反应[18-19]。研究发现，TNF-α在GDM患者血浆及胎盘滋养细胞中水平较高，其与GDM疾病严重程度有关，TNF-α可能是通过促进血管内皮损伤进而在GDM中发挥促进作用[20]。本研究显示，与NGT孕妇相比，TNF-α mRNA在GDM孕妇血清、胎盘组织中表达水平较高，与赵莉莉等[20]研究趋势一致，提示TNF-α mRNA可能参与GDM病变进程，推测高水平TNF-α可能通过触发炎症反应，与其受体相结合，进而影响胰岛素信号转导过程，促使胰岛素敏感性降低，引发IR，从而影响GDM病理变化。

国春蕾等[21]研究发现，GDM患者血清TNF-α水平与HOMA-IR呈正相关，孕早期监控血清TNF-α水平有助于提高GDM检出率，及早干预，有利于改善母婴结局。故本研究从转录水平分析了GDM孕妇血清、胎盘组织miR-802、TNF-α mRNA表达水平与FINS、TG、FBG、HOMA-IR的相关性，结果显示，miR-802、TNF-α mRNA表达水平与HOMA-IR呈正相关，与国春蕾等[21]研究结果相符，提示miR-802、TNF-α mRNA可能与IR共同影响GDM病变过程，推测miR-802、TNF-α mRNA可能通过介导IR进而参与GDM发生发展，但具体机制有待深入研究证实。此外，Yao等[7]研究发现，miR-802在结肠炎中表达水平较高，其可诱导TNF-α分泌。故本研究分析了GDM孕妇血清、胎盘组织miR-802表达水平与TNF-α mRNA的相关性，结果显示，血清、胎盘组织miR-802表达水平与TNF-α mRNA均呈正相关，提示miR-802、TNF-α mRNA可能共同影响GDM病变过程，但具体机制需结合基础研究加以证实。

综上所述，GDM孕妇血清、胎盘组织miR-802、TNF-α mRNA表达水平较高，与IR关系密切，miR-802可能是诊治GDM的潜在靶标。本研究样本较少，且未深入探讨miR-802在GDM中的作用机制，后期需结合基础研究、扩大样本量进行深入探究，为临床诊治GDM提供更有力证据。

利益相关声明：所有作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明：张瑶负责研究设计、实施、论文撰写和修改，魏若菡负责指导。