固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定药用蜂蜜中双酚类化合物

于晖，谢慧英，周鸿，胡航

江西省疾病预防控制中心，江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室，江西 南昌 330029

蜂蜜作为中药材收载于《中国药典》2020 年版一部［1］，也是蜜丸的重要辅料来源［2］，具有补中、润燥、解毒、止痛等药用功效，用于肺燥干咳、脘腹虚痛、肠燥便秘等。黄芪蜂蜜、三七蜂蜜、枸杞蜂蜜、党参蜂蜜、枇杷蜂蜜、益母草蜂蜜等药用蜂蜜对慢性病具有良好的辅助医疗作用［3-4］，深受大众的喜爱。然而人们往往忽视了存储蜂蜜的容器给人体带来潜在危害。聚碳酸酯和环氧树脂等有机材料，因其具备一定的抗冲撞性和轻便性［5］，成为人们用来存储蜂蜜的常用容器。由于聚碳酸酯和环氧树脂等合成材料的重要组成原料为双酚类化合物［6-7］，包括双酚A（bisphenol A,BPA），双酚F（bisphenol F,BPF）和双酚S（bisphenol S,BPS）。双酚类化合物对内分泌系统、生殖系统、免疫系统、神经系统等具有潜在的生理毒性，并具有一定的致畸性和致癌性，可导致动物生殖细胞的畸形和繁殖率的下降［8-10］。目前双酚类化合物的研究大多集中于谷物、肉类、桶装水等食品的检测［11-13］，而药用蜂蜜中双酚类化合物对人体健康造成潜在的危害方面报道较少［14］。因此准确测定药用蜂蜜中双酚类化合物，为研究药用蜂蜜中双酚类化合物对人体健康的影响有着重要意义。

由于多壁碳纳米管是一种具有良好吸附能力的纳米材料，本研究利用羧基化石墨多壁碳纳米管净化样品，联合超高效液相色谱—串联三重四级杆质谱法，建立一种快捷灵敏高效、精准稳定，适用于药用蜂蜜中双酚A、双酚F 和双酚S 的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC-30A 超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AB SCIEX QTRAP ○R5500 三重四级杆质谱仪（美国AB Sciex 公司）；TGL-16M 型高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；1-16K 小型高速（冷冻）离心机（德国Sigma 公司）；SK8200HP 型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）；Vortex-5 型涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；MG-2200 型氮吹仪（日本理化器械株式会社）。

乙腈中BPA 标准物质（100 μg/mL）、乙腈中BPS 标准物质（100 μg/mL）、乙腈中BPA-D4 标准物质（100 μg/mL）和甲醇中BPS-13C12 标准物质（100 μg/mL）均购自天津阿尔塔科技有限公司；甲醇中BPF 标准物质（10 mg/mL）购自美国AccuStandard公司；BPF-13C6 标准物质（纯度≥98.0%）购自加拿大TRC 公司；乙腈、甲醇、甲酸（质谱级，美国Merck 公司）；乙酸乙酯、丙酮（色谱级，美国Merck 公司）；羧基化多壁碳纳米管（MWCNTs-COOH，纯 度≥95%，直 径8～15 nm，长 度50 μm）和羧基化石墨多壁碳纳米管（GMWCNTs-COOH，纯度≥99.9%，直径8～15 nm，长度10-50 μm）均购自南京吉仓纳米科技有限公司；HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL）购自美国Waters 公司。10 批药用蜂蜜样品购自药店（批号分别为企业A：20 210126；企业B：20 191111；企业C：20 200401；企业D：20 200113；企业E：20 200805；企业F：20 210210；企业G：20 201218；企业H：20 200305；企业I：20 200101；企业J：20210220）。

1.2 标准溶液配制

1.2.1 标准使用液配制 用初始流动相稀释，配制成BPA 和BPF 浓 度均为500 ng/mL、BPS 浓度 为100 ng/mL 的标准使用液。

1.2.2 同位素内标使用液配制 用初始流动相稀释，配制成BPA-D4 和BPF-13C6 浓度均为100 ng/mL、BPS-13C12 浓度为20 ng/mL 的内标使用液。

1.3 样品前处理

1.3.1 试样提取 称取混匀的样品1.0 g于50 mL离心管中，加入100 μL 同位素内标使用液（1.2.2），加入25 mL 20%乙腈水溶液，涡旋混匀，超声提取20 min，以8 000 r/min于4 ℃离心5 min，上清液全部转移至另一50 mL 离心管中，加50 μL 甲酸，涡旋混匀，待净化。

1.3.2 净化 准确称取90.0 mg GMWCNTs-COOH，装填成两端有筛板的聚丙烯固相萃取柱，经12 mL甲醇和6 mL 纯水活化平衡，上样，6 mL 20%甲醇水溶液淋洗，用6 mL 甲醇-丙酮（4:1）洗脱，洗脱液氮吹至近干，用1 mL 初始流动相溶解残渣，于12 000 r/min 离心1 min，收集上清液待测。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；样品室温度：10 ℃；流动相：A，水；B，甲醇；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱程序为：0～5 min，20%B～100% B；5～6 min，100% B；6～6.1 min，100%B～20% B；6.1～9 min，20% B。进样量：2 μL。

1.4.2 质谱条件 离子源：ESI（-）；离子喷雾电压4 500 V；离子源温度120 ℃；脱溶剂温度：550 ℃；气帘气：35.0 L/h ；采用多反应监测扫描模式（MRM）进行采集。目标离子采集质谱参数见表1，目标化合物MRM 谱图见图1。

图1 BPA、BPF和BPS总离子图

表1 BPA、BPF、BPS及同位素内标的保留时间和质谱分析参数

2 结果与讨论

2.1 固相萃取填料的选择

比 较GMWCNTs-COOH、MWCNTs-COOH 和HLB 3种固相萃取柱对BPA、BPF 和BPS 的吸附效率，当样品添加水平为40 μg/kg 时，分别过GMWCNTs-COOH、MWCNTs-COOH 和HLB3种固相萃取柱，BPA、BPF 和BPS 的绝对回收率见图2。结果表明GMWCNTs-COOH、MWCNTs-COOH和HLB3种固相萃取柱对BPA、BPF 和BPS 的吸附效率为：GMWCNTs-COOH＞MWCNTs-COOH＞HLB。因 此选择GMWCNTs-COOH 作为固相萃取填料。这是因为碳纳米管具有共轭平面结构，相比于HLB 柱填料，与BPA、BPF 和BPS 的作用力较强［15］，而GMWCNTs-COOH 比MWCNTs-COOH石墨化程度高，缺陷较少，因此三种固相萃取柱中GMWCNTs-COOH 对BPA、BPF 和BPS 的吸附效率最高。

图2 不同固相萃取填料对BPA、BPF和BPS的吸附效率

2.2 固相萃取柱中GMWCNTs-COOH 柱容量的优化

分别考察了不同柱容量的GMWCNTs-COOH 固相萃取柱（30 mg、60 mg、90 mg、120 mg）对3 种目标化合物的回收率影响，结果见图3。

图3 不同柱容量对BPA、BPF和BPS的影响

实验表明BPA、BPF 和BPS 的绝对回收率随着GMWCNTs-COOH 柱容量的增大而增大，当固相萃取柱的柱容量大于90 mg 时，BPA、BPF、BPS的绝对回收率变化趋于平稳，因此固相萃取柱中GMWCNTs-COOH 柱容量为90 mg。

2.3 洗脱溶剂的选择

分别采用甲醇-丙酮（4:1）、乙酸乙酯、乙腈作为洗脱溶剂，对吸附在GMWCNTs-COOH 上的目标物进行洗脱，洗脱效率见图4。结果显示：甲醇-丙酮（4∶1）的洗脱效果优于乙酸乙酯和乙腈。因此选择甲醇-丙酮（4∶1）作为洗脱溶剂。

图4 不同洗脱溶剂对BPA、BPF和BPS的洗脱效果

2.4 标准曲线、检出限和定量限

配制BPA、BPF质量浓度为1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L，BPS 质量浓度为0.20 μg/L、0.40 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、4.0 μg/L、10 μg/L，同位素内标BPA-D4、BPF-13C6 浓度为10 μg/L，BPS-13C12 浓度2.0 μg/L 系列标准混合溶液，上机测定。以目标化合物和内标峰面积比值为纵坐标，目标化合物浓度为横坐标绘制标准曲线。使用3 倍信噪比（S/N=3）计算检出限，10 倍信噪比（S/N=10）计算定量限。3 种目标化合物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限见表2。

表2 3种目标物的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限

2.5 加标回收率和精密度

在蜂蜜中添加低、中、高三个水平标准溶液，每个水平6 份平行，按方法进行处理测定，BPA、BPS 和BPF 的平均加标回收率为87.7%～105.2%，RSD 为2.4%～5.3%。结果见表3。

表3 样品蜂蜜中3种目标物的加标回收率和精密度（n=6）

2.6 实际样品分析

使用本方法对10 份市售蜂蜜进行检测，其中1 份蜂蜜检出BPA，BPA 含量为3.9 μg/kg，BPS 和BPF 均未检出，结果见图5。

图5 样品中双酚A（BPA）及其内标子离子图

3 结论

本实验考察了采用不同固相萃取填料对药用蜂蜜样品中BPA、BPF 和BPS 的提取效率并建立了固相萃取-超高效液相-串联三重四级杆质谱同时测定药用蜂蜜中BPA、BPF 和BPS 的分析方法。本实验表明羧基化石墨多壁碳纳米管（GMWCNTs-COOH）有较好的吸附效果，且净化效果明显。同时实验使用同位素内标法定量，确保方法灵敏度、准确度和精密度均能够满足方法学检验要求。

本方法操作简便、准确、稳定，满足于大批量药用蜂蜜中BPA、BPF 和BPS 的检测需求，为进一步开展药用蜂蜜中双酚类化合物对人体健康危害评估提供了技术支撑。