唐榕,郭晨荔,梁培鑫,郭睿,王腾飞,何皇成,刘建国
(石河子大学新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆 石河子,832003)
油莎豆(Cyperus esculentusL.)起源于北非尼罗河流域,是一种块茎含油的草本能源植物,具有耐贫瘠、抗干旱、耐盐碱、产量高、易栽种、病虫害少等优良特点[1,2]。油莎豆集油、粮、饲功能于一体,极具开发利用价值。油莎豆块茎含油量25%左右,淀粉35%左右[3]。每公顷块茎干重产量可达8520 kg,产油量超过2550 kg,约为大豆的4 倍、油菜的2 倍、花生的1.5 倍[4]。油莎豆油既可做食用油也可制成生物柴油,作为绿色替代能源,又可加工成各类食品,美味可口[5,6]。新疆地处我国西北内陆干旱、半干旱地区,光热水等自然资源条件与北非尼罗河流域相似,沙性土壤地域较多,在油莎豆种植上具有巨大潜力[1]。
土壤盐碱化和次生盐碱化是世界性问题,严重影响着农业生产。新疆作为典型的干旱半干旱地区,其降水量小、蒸发量大、土壤含盐量高,据统计其各类盐碱土面积已达1.336×107hm2[7],约占全国盐碱土地的36.8%。新疆地域广阔,南、北疆气候及其它环境条件差异较大,土壤中盐分组成有较大差异。其中,塔里木盆地、吐鲁番盆地等南疆地区,土壤中盐分主要以碳酸盐、硫酸盐为主,该地区土壤碱性盐含量较高,导致pH 值较高。而北疆的伊犁、玛纳斯地区,因降水较多、Cl-淋洗强烈,土壤中主要以氯化物、硫酸盐等中性盐为主[8]。前人研究发现,在盐胁迫下环境通过渗透伤害和离子毒害,影响植物的生长,而碱胁迫环境下还伴有高pH 值,对植物影响更大。当根系附近土壤pH 值升高时Fe2+、Mg2+、Ca2+等一些金属离子开始沉积,同时伴随着无机阴离子的减少,影响植物对矿质营养的吸收,造成营养胁迫[9,10]。此外,Mg2+作为叶绿素合成的必要元素,Mg2+的沉淀,也会使得叶绿素合成受阻,光合作用减弱。Yang 等人[11]研究表明,随着盐浓度和pH 的增大,苜蓿叶片中净光合速率、气孔导度和胞间CO2浓度均有所下降。同时盐碱胁迫下植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心会受到损伤,使PSⅡ的光合作用活力和光合电子传递被抑制[12],叶绿体结构损伤,参与光反应和卡尔文循环的酶和蛋白下调[13]。而不同植物叶片色素含量还与其抗盐碱性和盐碱的种类、浓度有关。目前虽对植物在盐碱胁迫下的生理响应已有大量研究,但油莎豆作为新兴油料作物对其认知还不深入,特别是对盐碱胁迫的光合响应机制及盐碱胁迫的浓度效应尚不明确。本试验通过对油莎豆幼苗在不同浓度盐胁迫和碱胁迫下的光合生理响应进行研究,揭示其耐盐碱机制,为油莎豆在新疆大面积种植及合理划分种植区域提供理论依据。
以“中油莎1号”品种为材料,选取籽粒饱满、大小一致、无虫眼的种子。
实验选用2种中性盐(NaCl、Na2SO4)和2种碱性盐(NaHCO3、Na2CO3),分别按2∶1 的比例配成相应溶液进行胁迫处理。设盐胁迫和碱胁迫2 个处理组,每组设3个浓度梯度,分别用低浓度、中浓度、高浓度表示,经前期预备试验,设定盐胁迫低、中、高浓度依次为80、160、320 mmol·L-1,碱胁迫低、中、高浓度依次设定为40、80、120 mmol·L-1,共计6 个盐、碱胁迫组合,对照(CK)为蒸馏水+营养液,共7 个处理(表1)。
表1 各处理液盐分组成、摩尔比及pH值Table 1 Salt composition,molar ratio and pH of solutions for mixed salt treatments
选取成熟饱满的油莎豆种子,用5%的次氯酸钠溶液消毒15 min,蒸馏水冲洗5~10 次。将种子浸没在各处理下低浓度处理液中48 h(对照处理以蒸馏水浸没),充分吸水后置于装有湿润蛭石的发芽盒中,在培养箱中25 ℃黑暗萌发3 d,每天补水一次保持湿润,3 d 后从中选取露白种子备用。在19 cm×12 cm ×10 cm 的发芽盒中装入225 g 经121℃下高温灭菌后的蛭石,再加入300 mL蒸馏水或相应的盐溶液并搅拌均匀,挑选10粒露白种子均匀摆放在蛭石表面,覆盖100 g蛭石,后均匀浇灌200 mL 相应处理溶液,出苗后每隔5 d 用1/2 Hoagland 营养液透灌1 次。将其置于恒温培养箱中,昼/夜温度为30℃/25℃,时间为14 h/10 h,湿度75%。每天11:00 采用称重补水法及时补充水分,以保持其盐浓度不变。
1.4.1 叶绿素含量 幼苗生长15 d 后,取油莎豆中上部功能叶,擦净表面污物后剪碎混匀,每个处理称取0.2 g,均分成3 份,分别放入于研体中,加少量石英砂和碳酸钙粉及10 mL 95%乙醇研磨至组织变白,静止3~5 min 后过滤至25 mL 棕色容量瓶,以乙醇定容。分别在波长665 nm、649 nm 和470 nm下测定吸光度A665、A649 和A470。各光合色素含量计算公式为:
叶绿素A浓度(Chl a)=13.95A665-6.88A649
叶绿素B浓度(Chl b)=24.96A649-7.32A665
类胡萝卜素浓度(Car)=(1000A470-2.05Chl a-114.8Chl b)/245
叶绿素总浓度(Chl T)=Chl a+Chl b
光合色素含量(mg·g-1)=C×V×N/W
其中C 为色素浓度(mg·L-1),V 为提取液体积,N为稀释倍数,W为样品鲜重。
1.4.2 光合参数 选取中上部分功能叶,利用Li-6400光合仪(Li-Cor,美国)于晴天11:00-13:00点,测定系统采用开放式气路,光合有效辐射为设置为500µmol·m-2·s-1,叶室内空气流量设定为500 mL·min-1。测定净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、胞间CO2浓度(Ci)及水分利用效率(WUE),重复5 次。
1.4.3 叶绿素荧光参数 采用FMS-2 脉冲调制式荧光仪(Hansatech 公司,英国)测定初始荧光(F0)、最大荧光(Fm),最大光化学效率Fv/Fm、PSⅡ实际化学效率ΦPSⅡ,计算得出调节性能量耗散Y(NPQ),非调节性能量耗散Y(NO),光化学猝灭系数qP 和非光化学荧光淬灭系数qN。
采用Microsoft Excel 2010、SPSS 19.0 软件进行单因素Duncan 检验方差分析、相关性分析及主成分分析,SigmaPlot 12.5进行数据处理和作图。
在不同盐碱胁迫下Chl a、Chl b、Car、Chl T 含量均大致表现为下降趋势(图1)。其中随着盐胁迫的程度增加Chl a、Chl T、Car含量均呈现出先升高后降低的趋势,且在低浓度处理下到达最大值后显著下降,在中浓度处理下其含量较CK 处理分别降低45.34%、34.06%和60.81%,而Chl b 含量表现较为迟钝仅在高浓度处理下显著降低。表明轻度盐胁迫对叶片中光合色素并无显著影响,随盐胁迫的加剧其含量显著降低,且Chl a、Car 相较与Chl b 更为敏感。随碱胁迫的程度增加Chl a、Chl b、Chl T 含量均呈现出逐渐下降的趋势,其中Chl a、Chl T 含量均在低浓度下与CK 处理无显著差异,在中浓度处理下开始出现显著差异,分别降低26.84%、27.49%,Chl b 含量则仅在高浓度处理下显著低于CK,Car 含量表现出波动的趋势,且高浓度处理下与中,低浓度处理并无显著差异,且均显著小于CK 处理,依次降低31.93%、19.12%和30.55%。表明碱性土壤可显著降低植物中Car 含量,但随着土壤中碱性加剧Car含量表现并不敏感。
图1 盐碱胁迫对油莎豆幼苗叶片光合色素含量的影响Fig.1 Effects of different saline-alkali stresses on photosynthetic pigment contents of Cyperus esculentus leaves
随盐碱胁迫程度的加深Pn、Gs、Tr、WC 均呈下降趋势,且均在低浓度下较CK 处理达到显著差异(表2),其中盐胁迫下Pn依次降低35.36%、75.22%、91.46%,碱胁迫下依次降低43.69%、66.67%、65.64%。Ci在盐胁迫下表现为先下降后上升的趋势,且随浓度增加在低浓度下达到最小值减小16.42%,随后较CK 处理依次降低2.39%和升高15.85%,而碱胁迫下则呈不断降低的趋势,仅在高浓度处理下显著低于CK 处理。表明在低浓度下随Gs的减少Ci逐渐减少,而高浓度下因净光合速率显著下降,植物无法有效消耗胞间的CO2导致Ci显著升高。WUE 在盐胁迫下表现为先升高后下降的趋势,其低浓度处理下显著高于其它处理达到最大值,且其它处理间并无显著差异。而碱胁迫下则呈不断增加趋势,仅在高浓度处理达显著水平。
表2 不同盐碱胁迫对油莎豆幼苗叶片光合参数的影响Table 2 Effects of different saline-alkali stress on photosynthetic parameters of C.esculentus leaves
2.3.1 盐碱胁迫对油莎豆幼苗叶片F0、Fm、Fv/Fm及ΦPSⅡ的影响 由图2 所示,随盐碱胁迫程度的增加Fm、ΦPSⅡ、Fv/Fm均表现为下降的趋势,其中盐胁迫下Fm和Fv/Fm在中度胁迫下较CK处理开始显著降低,分别依次降低11.17%、21.26% 和1.25%、1.51%,而ΦPSⅡ则在低浓度下开始显著降低并在高浓度出现回升的趋势,其依次降低6.85%、18.52%、13.34%。而碱胁迫下ΦPSⅡ、Fv/Fm均在低浓度下开始显著下降,分别依次降低13.08%、17.83%、22.69%和1.4%、1.77%、2.54%。仅Fm在高浓度下显著下降,较CK 降低16.05%。F0随盐碱胁迫程度增加表现出先升高后下降的趋势,盐胁迫下在低浓度下最高,较CK 增加6.62%,其在高浓度下显著低于其他处理较其他处理分别下降15.97%、21.18%、15.34%。碱胁迫下在中浓度表现最高较CK处理增加12.13%。
图2 盐碱胁迫对油莎豆幼苗叶片F0、Fm、Fv/Fm及ΦPSⅡ的影响Fig.2 Effects of salt-alkali stress on F0,Fm,Fv/Fm and ΦPSⅡof C.esculentus leaves
2.3.2 盐碱胁迫对油莎豆幼苗叶片Y(NPQ)、Y(NO)、qP 及qN 的影响 随盐碱胁迫程度的增加Y(NPQ)和qN 均呈现出先增后降的趋势,且均在低浓度下达到最大后开始下降(图3),Y(NPQ)在低、中、高浓度盐和碱胁迫处理下较CK 分别依次增加44.71%、2.62%、-21.08% 和 120.65%、40.03%、36.61%,qN分别依次增加7.18%、-14.74%、-35.61%和37.66%、-6.54%、-11.53%。可看出碱胁迫下Y(NPQ)均大于CK 处理,而Y(NO)则表现出上升的趋势,在中、高浓度下较CK 处理达到显著差异,分别增加84.69%和110.16%。qP 随着盐碱胁迫程度增加表现为下降趋势,盐胁迫处理在低浓度下开始显著降低,依次降低7.6%、12.89%、9.94%,而碱胁迫处理下仅中高浓度较CK 处理显著降低,分别降低12.11%、13.14%。
图3 盐碱胁迫对油莎豆幼苗叶片Y(NPQ)、Y(NO)、qP及qN的影响Fig.3 Effects of saline-alkali stress on Y(NPQ),Y(NO)、qP and qN of C.esculentus leaves
2.4.1 相关性分析 将油莎豆盐碱胁迫后各项指标进行相关性分析,得到相关系数矩阵。由表3 可看出植物中Pn与Gs、Tr、Chl a 呈极显著正相关(P<0.01),与Car、Chl T、Fm、ΦPSⅡ、qP(P<0.05)呈显著正相关,而与Y(NO)表现为显著负相关。
表3 盐碱胁迫下油莎豆各指标的相关性分析Table 3 The correlation analysis of C.esculentus indexes under saline-alkali stress
2.4.2 主成分分析 对油莎豆盐碱胁迫下的16个光合生理指标进行主成分分析,提取特征值>1的3 个主成分,其特征值分别为9.169、4.055、1.244,方差贡献率分别为57.305%、25.346%、7.778%。累计方差贡献率达到90.429%,符合分析要求。由表4可知第一主成分综合了Pn、Gs、Tr、WC、Car、Chl T、Fv/Fm、ΦPSⅡ、Y(NO)、qP 和qN 的指标信息。第二主成分综合了WUE,Y(NPQ)的指标信息,综合得分(F)是每个主成分得分与对应贡献率乘积之 和 , 即 F=F1×57.305%+F2×25.346%+F3×7.778%。由表5 可知,油莎豆在不同处理下的综合得分分别为2.207、1.577、-1.166、-2.836、1.456、-0.039 和-1.198。相比较CK 处理盐胁迫下随胁迫程度增加得分依次下降0.629589、3.37354、5.043311,碱胁迫下依次下降0.751051、2.245727、3.405405,其各处理间排名为CK>低浓度盐胁迫>低浓度碱胁迫>中浓度碱胁迫>中浓度盐胁迫>高浓度碱胁迫>高浓度盐胁迫。
表4 主成分分析的成分载荷矩阵Table 4 Rotated component matrix of principal component analysis
表5 油莎豆不同盐碱处理的综合得分及其排名Table 5 The comprehensive score and ranking of C.esculentus under different saline-alkali stress
叶绿素是主要的光合色素,对光能的吸收、传递及转化起着重要的作用[11]。在本实验处理中因油莎豆耐盐和碱能力不同,通过前期预备实验,确定了盐胁迫和碱胁迫的浓度范围,其低、中、高浓度处理下碱性盐浓度比同处理下中性盐浓度分别减少了40、80 和200 mmol·L-1。实验结果表明随盐碱胁迫程度的增加,油莎豆叶绿素总量除低浓度盐处理外均成下降趋势。说明盐碱迫抑制了Chl T的合成,随其胁迫程度的增加,植物体内叶绿体逐渐发生降解,叶绿素结合蛋白或卟啉的形成速率降低[14,15],赵佳伟等人[16]研究发现,随盐胁迫程度的增加杜梨叶片中叶绿素含量呈逐渐下降趋势,而耐盐品种北美豆梨则在25 mmol·L-1浓度下叶绿素含量较CK 处理出现上升趋势。随着植物体内Na+的积累,叶绿体中基粒片层和类囊体结构的稳定性等都发生一定程度的损伤,最终造成叶绿素含量和叶绿体功能降低[17]。但在碱胁迫处理下土壤中pH 升高,导致铁、镁等合成叶绿素所必需的微量元素发生沉淀,从叶绿素的合成途径上造成破坏[18],使碱胁迫处理下油莎豆幼苗的叶绿素含量低于同浓度盐胁迫处理,且在低浓度碱胁迫下幼苗叶绿素含量相比于CK 处理均呈下降趋势[19]。在盐处理中各指标均在低浓度下达到最大,表现为促进效果,这与李秀霞等人[20]研究
结果一致,实验表明在低浓度处理下碱胁迫已对油莎豆幼苗造成一定伤害,而盐胁迫对油莎豆幼苗并未造成伤害,由此可初步说明油莎豆是耐盐植物。但也可能是在中性盐胁迫处理下,抑制了叶片生长,导致叶绿体收缩,产生“浓缩效应”或油莎豆幼苗为了抵御盐胁迫所带来的生理伤害而表现出的一种适应性生理响应[21]。
光合作用为植物生长发育提供物质基础,当植物遭受逆境时,其叶片的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Gi)、蒸腾速率(Tr)、叶绿素含量等均会受到一定程度的影响,且影响程度也因植物种类、品种、胁迫程度、时期等因素的不同而有所差异[22,23]。刘建新[24]等人研究发现,燕麦在盐、碱胁迫下Pn、Gs、Tr均呈下降趋势,其中Pn分别在100、50 mmol·L-1下开始显著降低,而Gi则表现为先下降后上升的趋势,分别在150、100 mmol·L-1下开始显著上升。本试验中,随着盐、碱胁迫处理浓度的增加,油莎豆幼苗中Pn、Gs、Tr、WC 呈现出下降趋势,且均在低浓度下显著降低,说明此浓度下植株光合作用已经受到明显抑制。张丽华等人[15]发现在高盐环境下,植物会通过降低Gs从而减少水分的散失,达到保持水分的作用。Tr的减少有助于维持水分的平衡,减少植物根系对盐分的吸收。但意味着植物吸收CO2的能力降低,这也是盐碱处理下Gi降低的主要原因,间接导致光合碳同化作用降低。但本实验中,在盐胁迫处理下随浓度的增加Gi表现为先下降后在中浓度下开始上升,其上升主要原因为光合速率严重减慢,使植物中CO2无法被有效利用而积累在胞间,导致Gi显著上升[25,26],碱胁迫则表现为下降趋势,表明油莎豆对中高浓度碱胁迫下有一定适应能力,受非气孔因素影响较少。由此可初步判断,在轻度盐碱胁迫下光合速率下降的主要原因是气孔因素引起的CO2供应不足,而随胁迫程度不断加重其主要原因转变为非气孔因素导致的CO2利用率降低。本实验中随碱胁迫程度递增,WC 逐渐下降,WUE 却不断升高,这表明在碱胁迫下植物可能通过降低WC,提高WUE,致使根系吸收较少的盐水,从而躲避盐碱对其造成的伤害,与贾旭梅等人[27]研究结果基本一致。WUE 增加也可能是植物相应WC降低的一种适应性反应,对植物在逆境中生长有重要意义[28],但在本研究中高浓度盐处理下随WC 的降低,WUE 显著降低,可能是植物受到不可逆的严重伤害,已失去自我调节能力,使其Pn显著降低。
叶绿素荧光参数是直接反映外界胁迫对植物光合作用内在影响的重要指标。F0为PSⅡ反应中心完全开放时的最小荧光产量,Fm为PSⅡ反应中心完全关闭时的最大荧光产量,很大程度上与PSⅡ反应中心上叶绿素a 含量有关。Fv/Fm为PSⅡ的最大光量子产量,反映了植物的潜在最大光合能力[29]。通过F0、Fv/Fm的变化可反映出PSⅡ反应中心的变化情况和可能的光保护机制[30]。在本研究中随盐碱胁迫程度的增加Fm、ΦPSⅡ、Fv/Fm均大致表现为下降的趋势,表明盐碱胁迫下导致植物光能的利用能力减弱,电子传递效率降低,ΦPSⅡ的光能转换效率降低[31]。植物在遭受盐碱胁迫后,光化学能量转化受到抑制,不能用于光合电子传递的,需要通过热耗散排出过剩的光能,避免器官受到损伤。Y (NPQ)、qN 等叶绿素荧光参数可反映植物排出过剩光能的能力[32],而Y(NO)则是表示植物光损伤的重要指标,其数值越高则说明植物光合器官受损越重。本研究中随盐碱胁迫的加重,Y(NPQ)、qN 均表现出先升后降的趋势,且均在低浓度处理下增加[33]。而Y(NO)则随盐碱胁迫的加重表现出上升趋势,且均在中浓度处理显著升高。说明油莎豆在一定浓度盐碱胁迫下,可启动其保护机制以抵御盐碱所带来的危害,但超过其耐受限度后,迅速失去自我保护能力,开始受到严重损伤。
盐碱条件下对植物光合作用的影响并非单因素造成,它与多个因素相关,且对其影响程度不一。因此对其多个光合生理指标进行相关性和主成分进行分析尤为重要。本实验中Pn与Gs、Tr、Chl a 呈极显著正相关,说明光合速率的减低在色素方面主要与叶绿素a 的降低有关,在气孔因素中主要与气孔导度和蒸腾速率有关,与Car、Chl T、Fm、ΦPSⅡ、qP成显著正相关,而与Y(NO)表现为显著负相关,因此以上相关指标可评价油莎豆的耐盐碱能力,且表明油莎豆在盐碱胁迫下除Y(NO)外,Gs、Tr、Chl a、Car、Chl T、Fm、ΦPSⅡ和qP 的降低均会不同程度地导致光合速率下降。在主成分分析中第一主成分综合了Pn、Gs、Tr、WC、Car、Chl T、Fv/Fm、ΦPSⅡ、Y(NO)、qP 和qN 的指标信息。第二主成分综合了Ci、WUE、F0、Y(NPQ)的指标信息。其中,Pn、Car、Chl T、Fv/Fm、ΦPSII、Y (NO)、qP 是反映受损程度的重要指标,Gs、Tr、WC 是调节光合作用的重要指标,这说明油莎豆主要通过降低Gs、Tr、WC 来适应盐碱胁迫;第二主成分中WUE 为节水指标,Y (NPQ)为热耗散保护指标,这说明油莎豆还可以通过提高水分利用率并开启热耗散调节机制来抵御盐碱胁迫。此外,从结果中可以看出,在中性盐和碱性盐浓度分别大于80 和40 mmol·L-1后,综合得分开始下降显著,并且在160和80 mmol·L-1时综合得分降幅最大。说明油莎豆具有一定的耐盐碱性,且同浓度下碱胁迫对其伤害更大。
近年来新疆油莎豆种植主要以南疆沙壤土为主,然而除北疆的阿勒泰、伊犁河谷及塔城部分地区土壤含盐较少以外,其它地区均出现不同程度的盐渍化[34]。结合实际,将盐、碱胁迫下低、中、高浓度可 分 别 换 算 为4.14、8.29、16.58 g·kg-1和2.2、4.39、6.59 g·kg-1的土壤总盐分含量。根据乔木[7]等人对塔里木盆地灌区土壤盐渍化分布特点的研究发现,其中天山南麓平原区、塔里木河冲积平原区、喀什三角洲区和叶尔羌河流域区的平均总盐含量均达到15 g·kg-1以上。阿尔金山山前平原区和昆仑山山前平原区平均总盐含量分别为7.13、6.35 g·kg-1,且土壤盐分组成主要以硫酸盐-氯化物为主。结合试验结果推测油莎豆可在塔里木盆地灌区中阿尔金山山前平原区及昆仑山山前平原区推广种植,其他灌区盐渍化程度较严重需要通过改良才可种植。自然环境中盐碱胁迫多以混合胁迫为主,且油莎豆在混合盐碱下的光合生理响应尚不明确,还需进一步研究。
盐胁迫和碱胁迫均会影响油莎豆光合作用,其中盐、碱胁迫下光合速率下降主要与Gs、Tr、Chl a 的降低有关。且油莎豆在盐碱胁迫下可通过降低Gs、Tr、WC 和提高WUE 以及启动热耗散机制来维持水分的供给和光合系统的动态平衡。在不同盐成分处理中中性盐浓度160 mmol·L-1、碱性盐浓度80 mmol·L-1时油莎豆幼苗综合得分降幅最大,在同浓度下碱胁迫抑制程度均大于盐胁迫。