大豆氮高效种质苗期筛选与鉴定

远月丽，易媛媛，战勇，陈李淼，袁松丽，黄毅，肖之源，张婵娟*，周新安*

（1.中国农业科学院油料作物研究所，农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，湖北 武汉，430062；2.中国农业科学院研究生院，北京，100081；3.福建农林大学农学院作物抗性与化学生态学研究所，福建 福州，350000；4.新疆农垦科学院作物研究所/国家大豆产业技术体系石河子综合试验站/谷物品质与遗传改良兵团重点实验室，新疆 石河子，832000）

氮是植物生长发育最重要的矿质元素之一，是植物叶绿体、核酸、蛋白质以及很多次生代谢产物的重要组成成分，施用氮肥能提高作物产量[1,2]。现代农业生产的强化种植，使得耕地土壤中可被直接吸收利用的氮源日渐有限。为提高作物产量，氮肥施用量逐年增加，占肥料年消耗的60%左右。我国氮肥年施用量超过0.26亿吨，氮肥利用率仅30%左右，远低于世界平均水平[3,4]。而且，大量施用化肥并未同比提高作物产量，高肥低效现象反而增加了农业生产成本，影响了农业可持续发展，造成不同程度的环境危害[5]。

大豆是喜氮作物，大豆籽粒形成需要大量氮素营养供给，高蛋白品种对氮素需求更高。大豆根瘤共生固氮将分子态氮N2转化为可被植物利用的氨，可满足豆科植物60%～70%的氮素需求[6，7]。但在苗期，大豆根瘤数量少，植株尚不能或很少利用根瘤菌共生固氮供给的氮素，土壤和肥料中的氮素是大豆苗期主要氮素来源[8]。但我国土壤普遍缺氮，过量施用化肥可能造成土壤酸化，流入江河湖海污染水资源[5]。选育氮肥高效利用的农作物品种是解决我国农业生产中环境与资源间矛盾的关键[9]。不同大豆品种的耐低氮能力存在差异，筛选氮高效利用种质资源、挖掘氮高效利用基因和培育氮高效品种是提高大豆氮利用效率、减少氮肥用量和提高大豆产量的有效途径。

近年来，国内在水稻[10]、小麦[11]、油菜[12,13]、棉花[14]、谷子[15]和烟草[16]等作物中开展了苗期氮高效利用材料的筛选与鉴定研究，将苗期株高、叶绿素含量、生物量、根系性状、氮积累量及氮吸收量等作为筛选指标，初步建立起氮高效评价指标体系。目前，大豆氮高效种质资源筛选研究相对有限。郝青南等[8]将干重、地上部分氮积累量、生物量增加值和氮吸收量作为判断大豆苗期耐低氮的指标，筛选出耐低氮型品种。本研究采用营养液培养方法，对78份大豆资源材料进行苗期耐低氮表型鉴定，通过分析各材料地上部分干重和总干重耐低氮胁迫指数，初步筛选出氮高效、低氮敏感和中间型大豆材料共8份，鉴定17个氮利用相关性状，筛选出耐低氮材料2011-X-618 和低氮敏感材料2011-X-531，为大豆耐低氮机制解析和氮高效大豆新品种选育提供了优异种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

选取大豆种质资源78 份（表3），由新疆农垦科学院作物研究所提供。

1.2 低氮处理方法

1.2.1 初筛实验 初筛实验在中国农业科学院油料作物研究所室外生长平台（带遮雨装置）进行，低氮处理参照郝青南等[8]的方法。

挑选大小一致、无花斑、无虫眼的种子，用纸卷法发芽，6～7 d 后幼苗长出真叶时，挑选长势一致的幼苗，移至水培盘中清水培养。采用规格为54 cm×36 cm 的泡沫板作为种植浮床，以海绵为固定基质，行株距6 cm×5 cm、种植孔径2 cm。待幼苗第一片真叶完全平展（3 d 左右），去掉幼苗子叶，将清水换成1/2 Hoagland 营养液生长4 d 后，开始进行处理。实验设正常氮（normal nitrogen, NN）和低氮（low nitrogen, LN）两种处理，每种处理设3 次重复。正常Hoagland 营 养 液 为0.472 g·L-1Ca(NO3)2·4H2O，0.252 5 g·L-1KNO3，0.04 g·L-1NH4NO3，0.068 g·L-1KH2PO4，0.246 5 g·L-1MgSO4·7H2O，0.004 6 g·L-1Fe-EDTA， 0.000 83 g·L-1KI， 0.006 2 g·L-1H3BO3，0.019 g·L-1MnSO4·H2O，0.008 6 g·L-1ZnSO4·7H2O，0.000 024 g·L-1CuSO4·5H2O，0.000 24 g·L-1Na2MO4·2H2O，0.000 027 g·L-1CoCl2·6H2O。各试剂均为国产分析纯。低氮营养液含0.047 2 g·L-1Ca(NO3)2·4H2O， 0.025 25 g·L-1KNO3， 0.004 g·L-1NH4NO3，其它成分不变，缺少的Ca2+和K+分别用CaCl2·2H2O 和K2SO4补足。正常氮营养液氮素含量为7.5 mmol/L；低氮营养液氮素含量为正常氮的1/10，即0.75 mmol/L。每个水培盘装7 L 营养液，每三天更换一次营养液。处理18 d 后，取样并进行生物量测定。1.2.2 复筛实验 复筛在人工控制光温的温室内进行，光照周期为16 h 长日照条件，温度控制在27±2℃，光照强度为30 000 LUX 左右，相对湿度为65%～85%。

由于使用Hoagland 营养液在温室进行低氮处理时，大豆叶片容易长褐斑，因此采用添加NH4NO3的B&D 无氮营养液[17]代替Hoagland 营养液。复筛时正常氮营养液配方如表1 所示，氮含量为7.5 mmol/L；低氮营养液氮素含量为正常氮的1/10，即0.75 mmol/L，其他营养物质含量不变。去掉子叶后，将材料在1/2 正常氮营养液中的培养时间由初筛的4 d 缩短为2 d，将处理时间由初筛的18 d 缩短为12 d。其余实验方法与步骤同初筛。处理12 d后，进行相关指标测定。

表1 大豆苗期水培实验正常氮营养液组分Table1 Normal nitrogen nutrient ingredients for soybean seedling growth

1.3 测定指标

1.3.1 叶绿素含量与株高 复筛时，低氮和正常氮处理12 d后，使用便携式叶绿素仪SPAD-502Plus测定幼苗顶端第三片完全展开叶的叶绿素相对含量；使用直尺测量幼苗株高，所测株高为从子叶节至生长点的长度。设置3 次重复，每个重复测定3株苗。

1.3.2 根构型相关性状 复筛时，低氮和正常氮处理12 d 后，用剪刀在幼苗长有侧根的部位剪下，将根组织从幼苗分离，自来水冲洗干净，放入装有蒸馏水的透明根盘（25 cm×20 cm）中，将侧根逐一分开，用根系扫描仪（Epson V800）扫描获得TIF 图片，使用WinRHIZO 根系分析系统对扫描图像进行分析，获取总根长（TRL,cm）、根尖数（RTN）、根体积（RV, cm3）、根表面积（RSA, cm2）和根直径（RAD,mm）性状数据。设置3 次重复，每个重复测定3 株幼苗。

1.3.3 生物量测定 初筛时，低氮和正常氮处理18 d后，收获大豆幼苗，将根组织和地上部组织分别置于105℃烘箱杀青30 min，60℃烘干至恒重，用万分之一天平准确称量地上部分干重（SDW）和地下部分干重（RDW），计算总干重（TDW）。设置3次重复，每个重复测定3株幼苗。

复筛时，低氮和正常氮处理12 d 后，按照初筛时的方法称量每种材料的地上部干重和地下部干重，并计算总干重与根冠比（RSR）。

计算公式如下：

总干重=地下部分干重+地上部分干重；

根冠比=地下部分干重/地上部分干重。

1.3.4 氮含量测定 复筛时，将用于生物量测定的样品继续进行氮含量的测定。氮含量测定采用凯氏定氮法。氮含量测定完毕后同时计算整株氮含量（%）及整株总氮（mg）。

计算公式如下：

地上部总氮（mg）=植物地上部分干重（g）× 地上部分氮含量（%）×1000；

地下部总氮（mg）=植物地下部分干重（g）× 地下部分氮含量（%）×1000；

整株总氮（mg）=地上部总氮（mg）+地下部总氮（mg）；

整株氮含量（%）=总氮量（mg）/（总干重（g）×1000）×100。

1.4 数据分析

采用Microsoft Office Excel（2013）和IBM SPSS Statistics20.0软件整理分析实验数据。

2 结果与分析

2.1 不同氮处理生物量差异

不同资源材料地上部分干重、地下部分干重和总干重变异系数在低氮处理条件下分别达到29.20%、30.40%和28.44%，在正常氮处理条件下分别为30.04%、28.08%和29.14%，表明不同资源材料的生物量在两种氮水平下均表现出很大的差异（表2）。

表2 78份大豆种质在正常氮和低氮条件下苗期生物量的差异Table 2 Differences in seedling biomass of 78 soybean accessions under normal and low nitrogen conditions

本实验计算比较耐低氮胁迫指数（表3），以地上部干重及总干重耐低氮指数均大于0.8 为标准，初步筛选3 份耐低氮材料2011-X-559、2011-X-618、2011-X-639，以地上部干重及总干重耐低氮指数均小于0.6 为标准，筛选出3 份低氮敏感材料2011-X-472、2011-X-531、2011-X-547 及2 份中间型材料吉育86、东农53。

表3 78份大豆种质及干重耐低氮胁迫指数Table 3 Seventy-eight soybean accessions with their low nitrogen tolerant indexes of dry weight

2.2 苗期耐低氮材料筛选指标

2.2.1 变异分析 低氮处理后，17 个性状指标均发生了显著变化，具体表现为地上部干重、总干重、氮含量、总氮量、株高和叶绿素含量显著降低；地下部干重和根冠比显著增加；根构型指标除根直径显著降低外，其他性状指标均显著增加（表4）。不同氮素水平下，大豆苗期株高、根尖数、根体积、根表面积等的变异系数都大于12%，表明耐低氮性在不同材料间差异大（表4）。在正常氮处理下，17 个性状变异系数范围为4.06%～24.58%，其中以株高、根尖数、地上部干重、地下部干重和总干重较大；在低氮胁迫下，各指标变异系数范围为4.51%～26.13%，其中以根尖数、株高、根体积、根表面积和总根长较大；比较耐低氮胁迫指数，各指标变异系数范围为4.45%～17.37%，其中以地上部总氮、株高、整株总氮、地下部总氮和根体积较大（表4）。

表4 8份大豆材料苗期各指标的变异情况Table 4 Variation of each index of 8 soybean accessions at seedling stage

2.2.2 相关性分析 为进一步筛选出评价大豆耐低氮能力的指标，对所测定的17个指标进行相关性分析。在正常氮条件下，各指标间表现出明显的相关性，植株总干重与根体积呈极显著正相关（r=0.949**）；整株氮含量与地上部氮含量呈极显著正相关（r=0.954**）；整株总氮与总干重呈极显著正相关（r=0.971**）；总根长与根表面呈极显著正相关（r=0.872**）；根体积与整株总氮呈极显著正相关（r=0.913**）。在低氮条件下，各指标间表现出明显的相关性，植株总干重与地上部干重呈极显著正相关（r=0.987**）；整株氮含量与总干重呈极显著负相关（r=-0.898**）；整株总氮与地上部总氮呈极显著正相关（r=0.939**）；总根长与根表面积呈显著正相关（r=0.829*）；根表面积与根体积呈极显著正相关（r=0.925**）；根体积与总干重呈显著正相关（r=0.725*）（表5）。

表5 8份大豆材料苗期各表型性状在正常氮水平（对角线上方）和低氮水平（对角线下方）的Pearson相关系数Table 5 Pearson correlation coefficients of traits of 8 soybean accessioins at seedling stage under normal(above the diagonal)and low(below the diagonal)nitrogen conditions

2.2.3 主成分分析 对17个性状耐低氮胁迫指数进行主成分分析。主成分分析结果表明，3 个主成分的累积贡献率可以达到81.25%，说明这3 个成分具有较强的代表性（图1）。主成分1 的方差贡献率为47.81%，在主成分1 中，除了地下部氮含量为负向载荷外，其余性状均为正向载荷，其中向量值较大的性状包括根冠比、地下部干重、整株总氮、地上部总氮、总干重和地上部干重，可概括为“生物量因子”；主成分2 可以反映所有变异的20.75%，与主成分2较相关的性状包括地下部氮含量、地下部总氮、整株氮含量、根表面积、根体积和平均根直径，可概括为“根系形态因子”；主成分3 可以解释全部变异的12.68%，与主成分3 较相关的性状有叶绿素含量、总根长和地上部氮含量（图1）。

图1 大豆幼苗17个氮利用相关性状的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of 17 traits related to nitrogen use efficiency at soybean seedling stage

结合各性状指标的变异系数、相关性分析和主成分分析，将总干重、整株氮含量、整株总氮、总根长、根表面积和根体积6 个指标作为苗期间接判定大豆耐氮能力的依据。

2.3 氮高效及低氮敏感大豆资源精准鉴定

不同大豆材料苗期总干重、整株氮含量和整株总氮性状的耐低氮指数均小于1，而总根长、根体积和根表面积性状的耐低氮指数均大于1，分布于1.13到1.73范围之间，表明在低氮胁迫条件下大豆会通过促进根系的生长来获取更多的氮素（表6）。其中，2011-X-618 的整株总氮、总根长、根表面积、根体积4 个指标的耐低氮指数在8 个材料中均表现为最大值，总干重、整株氮含量2个指标的耐低氮指数分别位于第2、4 位。2011-X-531 总干重、整株总氮、根体积3 个指标的耐低氮指数在8 个材料中均表现为最小值，整株氮含量、总根长、根表面积3 个指标的耐低氮指数分别位于第6、7、7位。

表6 8份大豆材料耐低氮胁迫指数比较Table 6 Comparison of low nitrogen tolerance index of 8 soybean accessions

由图2 可以看出，与正常氮条件下相比，材料2011-X-618在低氮胁迫下植株地上部变化较小，叶片轻微变黄，根系极为发达；而2011-X-531 在低氮胁迫下植株矮小，与正常氮条件下表型差异较大，其根系相比正常氮条件下发达程度变化较小。因此，对比8 个大豆材料的6 个性状耐低氮胁迫指数，并结合两个氮素水平下性状表现值，可以初步认为2011-X-618 为大豆苗期耐低氮材料，2011-X-531为大豆苗期低氮敏感型材料。

图2 不同氮浓度处理下氮利用效率差异大豆材料植株表型Fig.2 Phenotype of soybean accessions with different nitrogen use efficiency under nitrogen stress

3 讨论

一般植物耐低营养筛选的环境有土培、沙培和水培等，水培的优点在于它能准确地控制营养介质，快速筛选大批量的基因型。为缩短筛选时间、加快筛选速度，本试验采用水培法在苗期进行筛选。筛选浓度也很重要，如果浓度太低，极不耐低氮的基因型会逐渐枯萎，浓度太高则会加重筛选压力，优良基因型的遗传优势得不到充分发挥。本实验所采用的低氮浓度是经预实验后确定的，浓度与郝青南等[8]采用的一致。

在氮高效型品种筛选过程中，应尽量减少环境、养分以及病虫害等因素的影响，因此筛选指标的确定尤为重要。由于缺氮会导致植物体一系列的表型性状发生直接或间接的变化，所以选择与缺氮密切相关且容易被测定的表型性状作为初级筛选指标，或可提高氮高效利用基因型的筛选效率。陆潭及王金生等在耐低钾大豆品种筛选及大豆营养高效利用型品种筛选中均将生物量作为重要的筛选指标[18，19]。本实验中，两种氮素水平下不同基因型生物量表现出很大的差异，因此本研究选择将植株干重作为初步筛选指标。

植物根形态构型具有可塑性，植物可以通过调节自身根的形态和构型来适应外界的环境条件，并影响植物种内和种间的竞争关系[20,21]。植物对土壤中氮素的获取很大程度上取决于其根系形态。有报道显示低氮胁迫显著影响根系形态特征[22]。近年来，在小麦和玉米等作物中均有根构型与氮效率相关的报道[23,24]。大豆中已有关于根构型与磷效率研究相关的报道，发现土壤中磷的有效性等环境因素对根构型具有调节作用；具有较好根形态构型的大豆基因型有利于从土壤中吸收有效磷和其它养分[25～27]。尹元萍等[28]利用根系形态构型成功筛选磷高效大豆基因型。在大豆中，关于根构型与氮利用效率相关报道较少。本实验结果表明，低氮胁迫条件下大豆幼苗通过增加根体积、根表面积、总根长和根尖数等根系性状从营养液中获取更多的氮素，用于植株的生长发育。本研究结果也显示，在低氮条件下，大豆幼苗的生物量与根体积、平均根直径呈显著相关，植株根体积与根表面积呈极显著正相关，根表面积与总根长、平均根直径与植株总氮呈显著相关。这些结果说明，可以将根体积、根表面积和总根长作为重要筛选指标。

4 结论

大豆苗期耐低氮筛选指标的确定还没有相应的报道，建立科学快速高效的氮高效资源筛选方法和技术指标显得十分必要。水稻、玉米和小麦等作物已经建立了苗期氮高效评价指标体系。本实验综合这些作物评价氮高效的指标以及大豆本身固有的氮素利用特点，测定相关性状指标，通过主成分分析及相关性分析，将总干重、整株氮含量、整株总氮、总根长、根表面积、根体积六个指标作为苗期耐低氮大豆资源的精细鉴定指标，并通过耐低氮胁迫指数来修正环境因素的影响和不同材料自身生物性状背景的差异。参照上述指标综合评价，筛选出氮高效材料2011-X-618 和低氮敏感型材料2011-X-531。