PCI术后血清miR-9、miR-204表达水平对急性冠脉综合征病人预后的预测价值

万 荣，宋春慧，宋 志

急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是缺血性心血管疾病，具有发病急、病死率高的特点，严重影响病人生命安全及生存质量[1]。目前，临床多采用经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)手术治疗ACS，但病人仍易再发生不良急性事件[2]，临床仍缺乏有效监测ACS病人介入治疗前后病情变化的生物指标。研究发现，微小RNA(microRNA，miRNA)在基因转录及表达过程中有调控作用，参与ACS的发生发展[3]，其中微小RNA-9(miRNA-9，miR-9)在ACS中表达下调，其可能通过抑制动脉粥样硬化斑块形成，促进血管重塑，进而在ACS发病过程中发挥重要作用[4]；另外，miR-204-5p是微小RNA-204(miRNA-204，miR-204)其中一员，在ACS病人中表达失调，miR-204-5p有望成为诊治ACS的靶标[5]。但血清miR-9、miR-204在ACS病人中PCI治疗前后的情况鲜有报道。本研究通过观察血清miR-9、miR-204在ACS病人PCI治疗前后的变化，记录1年内ACS病人发生主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)情况，旨在分析miR-9、miR-204与ACS病人发生MACE的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年10月—2019年1月于枣庄矿业集团中心医院就诊并进行介入治疗的123例ACS病人(ACS组)，其中男94例，女29例；年龄47～73(65.44±10.87)岁；收集病人左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、纽约心脏病协会(New York Heart Association，NYHA)心功能分级、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高血压、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、糖尿病、总胆固醇(total cholesterol，TC)、ACS病人类型、PCI术中植入支架数等情况。选取同期121名体检健康者进行对照研究(健康组)，其中男96名，女25名；年龄47～73(64.98±10.77)岁。健康体检者均进行病史询问，胸片、心电图、心脏及腹部彩超等检查，排除高血压、糖尿病、冠心病等疾病。健康组与ACS组性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象或其家属均知情同意并签署知情同意书，且本研究获得医院伦理委员会审核、批准。

1.2 诊断标准 参考中国医师协会急诊医师分会制定的《急性冠脉综合征急诊快速诊疗指南》[6]有关ACS的相关诊断标准进行判定。

1.3 纳入与排除标准 纳入标准：所有病人均符合ACS诊断标准；冠状动脉造影显示存在明确血管病变；心电图出现连续两个或以上导联典型心肌缺血改变。排除标准：合并肺源性心脏病、先无性心脏病、心脏瓣膜病、心包疾病等其他器质性心脏病者；合并结缔组织病、严重肝脏疾病、自身免疫性疾病者；合并全身各系统肿瘤、甲状腺功能异常者；合并梗阻性肾病、肾炎、泌尿系统感染者。

1.4 试剂与仪器 TRIzol 试剂(货号：BYX1617P)购于常州贝源鑫生物科技有限公司，microScript microRNA cDNA Synthesis Kit(货号：NGB-54415)购于艾美捷科技有限公司，Mir-XTM miRNA First Strand Synthesis Kit(货号：638315)购于上海善然生物科技有限公司。全自动生化分析仪(型号：DXC600)购于北京泰林东方商贸有限公司；超微量紫外分光光度计(型号：NanoDrop One-w)购于北京智杰方远科技有限公司，实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：ABI StepOnePlus)购于上海奥陆生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 标本采集 采集ACS病人入院时、介入治疗后3 d内静脉血4～5 mL，健康体检者空腹静脉血4～5 mL，室温下凝集30 min，4 ℃ 6 500 r/min离心8 min，分离血清，-80℃冰箱中冻存，待检测。

1.5.2 qRT-PCR法检测血清miR-9、miR-204表达水平 解冻血清样本，以TRIzol试剂抽提总RNA。根据microScript microRNA cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA为模板，按照TaqMan®Gold RT PCR试剂盒说明书配制反应体系，进行PCR反应。miR-9、miR-204均以U6为内参基因，引物序列见表1。以2-△△CT法计算miR-9、miR-204相对表达量。

表1 miR-9、miR-204及U6的引物序列(5′-3′)

1.6 随访 ACS病人介入治疗后出院，采用门诊随访、电话或再次入院等方式随访1年，记录发生MACE情况。在随访期间有93例ACS病人未发生MACE(非MACE组)，有30例ACS病人发生MACE(MACE组)，其中发生严重室性心律失常3例，发生充血性心力衰竭再次入院10例，心源性猝死2例，再次发生非致命性ACS15例(再次行冠状动脉搭桥手术4例，再次行冠状动脉支架手术9例，再次心绞痛行血运重建术2例，予以药物强化治疗)。

2 结 果

2.1 健康组与ACS组血清miR-9、miR-204水平比较 与健康组比较，ACS组病人治疗前血清miR-9、miR-204水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 健康组与ACS组血清miR-9、miR-204水平比较(±s)

2.2 ACS病人治疗前后血清miR-9、miR-204水平比较 ACS组病人治疗后血清miR-9、miR-204水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 ACS病人治疗前后血清miR-9、miR-204水平比较(±s)

2.3 两组不同预后ACS病人临床资料及治疗后血清miR-9、miR-204表达水平比较 非MACE组与MACE组比较，NYHA心功能分级中Ⅱ级或Ⅲ级比例、高血压比例、治疗后血清miR-9、miR-204表达水平，差异均有统计学意义(P<0.05)，年龄、男女比例、LVEF、LDL-C水平、HDL-C水平、糖尿病比例、TC水平、ACS亚型比例、PCI术中植入单枚或多枚支架比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 不同预后ACS病人临床资料及治疗后血清miR-9、miR-204表达水平比较(±s)

2.4 Logistic回归分析ACS病人发生MACE的影响因素 以ACS病人是否发生MACE为因变量，以治疗后miR-9水平、miR-204水平、NYHA心功能分级、高血压为自变量进行Logistic回归分析，结果显示，NYHA心功能分级、高血压是ACS发生MACE的危险因素(P<0.05)，miR-9、miR-204是ACS病人发生MACE的保护因素(P<0.05)。详见表5。

表5 ACS病人发生MACE影响因素的Logistic回归分析

2.5 治疗后血清miR-9、miR-204水平对ACS病人发生MACE的预测价值 ROC曲线显示，治疗后血清miR-9水平预测ACS病人发生MACE的ROC曲线下面积(area under curve，AUC)为0.801，95%CI(0.749，0.864)，截断值为0.85，其灵敏度、特异度分别为86.2%、67.8%；治疗后血清miR-204水平预测ACS病人发生MACE的AUC为0.791，95%CI(0.734，0.848)，截断值为0.82，其灵敏度、特异度分别为84.6%、66.9%；治疗后血清miR-9、miR-204水平联合预测ACS病人发生MACE的AUC为0.889，95%CI(0.848，0.931)，对应灵敏度、特异度分别为84.6%、81.0%。详见图1。

图1 治疗后血清miR-9、miR-204水平预测ACS病人发生MACE的ROC曲线

3 讨 论

心血管疾病是世界范围内死亡的主要病因，其中动脉粥样硬化性心血管疾病即冠心病对死亡率影响最大，ACS是冠心病的危重类型，对人类健康构成极大威胁[7-8]。此外，PCI手术治疗可重建血流，减少心肌缺血梗死面积，是治疗ACS的常用方法，但病人术发生MACE概率仍较高，因此，寻找可用于监测ACS病情变化及预后评估的指标并及时干预，对改善ACS病人预后具有重要意义。

miRNA广泛分布于组织、器官及外周血液中，可在免疫调节、炎症反应、信号传导、血管重塑等生物学过程中发挥重要调节作用，与心肌梗死、ACS等疾病密切相关[9-10]。研究发现，血清miR-186-5p水平在ACS病人入院时明显高于健康对照组，其表达水平经冠脉介入治疗后明显降低，miR-186-5p可能通过调节葡萄糖代谢及炎症反应，进而影响ACS发病进程，其表达水平有助于监测ACS病人介入治疗后的临床状况及评估预后[11]；另外，miR-146a在ACS病人血清中水平升高，PCI术后，其水平降低，miR-146a可作为监测ACS病情变化及预后评估的指标[12]。以上研究表明，异常表达的miRNA与ACS病变过程密切相关，miRNA具有评估ACS病情及预后的潜在价值。既往研究显示，miR-9-3p在冠心病中呈低表达，其通过影响内皮细胞增殖及迁移，进而在冠心病发展进程中发挥作用[13]；另外，miR-9-5p在心肌梗死中表达异常，miR-9-5p可通过抑制线粒体凋亡途径，降低缺血损伤，抑制心肌细胞凋亡，从而在心肌梗死疾病进展中发挥作用[14]。以上研究表明，表达失调的miR-9与缺血类心血管疾病有关。本研究中ACS组病人治疗前血清miR-9水平明显低于健康组，与相关研究结果[3]一致，且ACS病人经介入治疗后，血清miR-9水平明显上调，提示miR-9可能参与并影响ACS疾病发展过程，其水平有利于评估ACS病情及预后。推测miR-9可能通过影响内皮细胞增殖、迁移、血管重塑、动脉粥样硬化斑块形成等生理病理过程，从而在ACS疾病进展中发挥一定作用，但具体机制有待进一步探究。Wu等[15]应用定量RT-PCR技术对生物信息学分析发现miR-204与心肌梗死病理发展关系密切，具有诊断心肌梗死的潜在价值；此外，miR-204在心肌损伤的小鼠中呈低表达，其可能影响心室重构及心功能[16]。本研究中ACS组病人治疗前血清miR-204水平明显降低，经介入治疗后，miR-204水平明显升高，提示miR-204可能与ACS发生发展相关。推测miR-204作为miRNA成员，其可能通过影响细胞凋亡、内皮细胞增殖、迁移过程，进而在ACS发生发展中发挥抑制作用，其机制仍需深入研究证实。

本研究中MACE组病人心功能分级Ⅱ级或Ⅲ级比例、高血压比例均明显高于非MACE组，治疗后血清miR-9、miR-204表达水平明显低于非MACE组，提示心功能分级、高血压血清miR-9、miR-204表达水平均可能与ACS病人PCI治疗后预后情况有关。本研究显示，血清miR-9、miR-204诊断ACS病人发生MACE的AUC分别为0.801、0.791，当血清miR-9相对表达量低于0.85或miR-204低于0.82时，ACS发生不良预后概率增加，提示血清miR-9、miR-204对ACS病人发生MACE均有一定预测价值，血清miR-9、miR-204联合预测ACS病人发生MACE的AUC为0.889，相应灵敏度为84.6%，特异度为81.0%，提示两者联合可有效提高预测ACS病人发生MACE的特异度，增加ACS病人预后诊断效能。进一步研究发现，NYHA分级、高血压是ACS发生MACE的危险因素，miR-9、miR-204是ACS发生MACE的保护因素，提示NYHA心功能分级越高、治疗后血清miR-9、miR-204水平越低，合并高血压均会增加ACS病人发生MACE的风险，及时确定上述指标，有助于早期评估ACS病人预后。

综上所述，血清miR-9、miR-204在ACS病人中表达下调，经PCI治疗后，两者水平升高，与预后相关，检测血清miR-9、miR-204水平可辅助监测ACS病情及预后评估。但本研究未深入探究miR-9、miR-204影响ACS病人预后的具体机制，后期将进一步研究。