基于IL-1β信号通路探讨当归芍药散对SAMP8小鼠学习记忆的影响

潘艳芳，贾晓涛，屈梦扬，方 艳，应小平

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种与年龄相关的中枢神经系统原发性退行性疾病，主要表现为进行性认知功能障碍、精神行为异常、生活能力下降，晚期出现严重痴呆[1]。截至2019年，我国共有1 000多万例阿尔茨海默病病人，约占全球阿尔茨海默病总数的五分之一[2-3]，至今仍无法治愈，其发病机制也尚不明确。研究证实，脑内β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积是阿尔茨海默病形成过程的核心事件[4]。β淀粉样蛋白可以引起氧化应激、轴突损伤和突触丢失等级联反应，最终导致神经元死亡[5-6]。因此，减少β淀粉样蛋白过度产生和聚集是遏制阿尔茨海默病发生发展的关键步骤。研究显示，神经炎症的重要组分白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)能够通过加快β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)的产生来促进β淀粉样蛋白的合成聚积[7]。因此，减少炎性因子IL-1β能够减少β淀粉样蛋白的沉积。2019年加州大学的研究人员在PNAS期刊上发表的研究表明，一种名为TOM1的蛋白质能够将IL-1β及其受体IL-1R带入胞内进行降解，减轻炎症反应[8]。当归芍药散(DSS)是出自《金匮要略》治疗阿尔茨海默病疗效确切的经方，前期研究表明其具有抗衰老、抗炎症的作用[9-10]。本研究探讨当归芍药散通过IL-1β通路降低脑内炎症反应，减少脑内β淀粉样蛋白沉积来防治阿尔茨海默病的机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂 快速老化SAMR1小鼠10只、SAMP8小鼠30只均由成都达硕实验动物有限公司提供，采用随机数字表法对实验动物进行编号，按照机遇均等原则分为SAMR1组、SAMP8组、DSS 15 g/kg组和DSS 60 g/kg组，每组10只。SAMR1组小鼠作为对照组，DSS 15 g/kg组和DSS 60 g/kg组小鼠分别给予15 g/kg、60 g/kg剂量的当归芍药散灌胃，每日1次；SAMR1组和SAMP8组小鼠给予相应体积的生理盐水(每10 g 0.1 mL)灌胃，每日1次。连续灌胃8周后进行行为学实验，实验结束后取大脑皮层和海马组织于-80 ℃储存待检测。

1.2 Morris水迷宫实验 通过水迷宫实验系统，进行小鼠空间学习记忆能力的检测。全部测试包括定位航行试验、空间探索试验、可视平台试验。每天连续训练4次，每次间隔20 min，连续训练5 d。自由录像系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径，4次训练即将小鼠分别从4个不同的起始点(不同象限)放入水中，小鼠找到平台后或120 s内找不到平台(潜伏期记为120 s)，则由实验者将其引导到平台，在平台上休息10 s，再进行下一次试验。第6天移除平台，将大鼠放置在起点，记录小鼠寻找平台所需的时间以及路径。主要观察指标有：小鼠找到水下平台的平均逃避潜伏期和平均逃避距离、撤除平台后小鼠在目标象限内的游泳时间和距离百分比以及游泳速度等。

1.3 Y迷宫实验 通过Y迷宫检测小鼠的工作记忆能力。Y迷宫由3个夹角为120°的支臂组成。实验开始时，将小鼠放入3臂的交汇处，让其自由探索8 min，记录分析各臂小鼠的进入顺序、进入时间及进臂的总次数以及每次进臂的顺序，并计算进臂正确率。进臂正确率=进臂正确的次数/(进臂总次数-2)×100%。

1.4 神经炎性因子的检测 收集的海马组织用RIPA裂解缓冲液(150 mmol/L NaCl，0.5%脱氧胆酸钠，5 mmol/L EDTA，0.5%NP-40，50 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8)匀浆。将样品的组织匀浆在4 ℃下全速离心15 min。蛋白质定量试剂盒(BCA)法进行蛋白浓度测定(试剂盒购自美国Thermo Pierce公司)。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测组织裂解物中IL-1β、TNF-α和IL-6水平(试剂盒购自美国R&D公司)。

2 结 果

2.1 各组小鼠Morris水迷宫实验比较 小鼠Morris 水迷宫行为学实验发现，在连续5 d寻找水下平台测试中，与SAMR1组小鼠比较，SAMP8组小鼠寻找水下平台的日均潜伏期明显延长(见图1A)，穿越平台象限时间和距离占整个游泳时间(见图1C)或距离(见图1D)的百分比下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；而DSS 60 g/kg组小鼠寻找水下平台的日均潜伏期较SAMP8组明显缩短，穿越平台象限时间和距离占整个游泳时间或距离的百分比均上升，差异均有统计学意义(P<0.05)。与SAMP8组小鼠比较，DSS 15 g/kg组小鼠寻找水下平台的日均潜伏期、穿越平台象限时间和距离占整个游泳时间或距离的百分比比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

与SAMR1组比较，＊ P<0.05；与SAMP8组比较，# P<0.05。图1 各组小鼠Morris水迷宫实验比较(A为寻找水下平台的潜伏期；B为第5天各组小鼠寻找水下平台的代表性游泳轨迹；C为目标象限的时间百分比；D为目标象限的距离百分比)

为了排除药物对大鼠运动能力的影响，各组小鼠进行了水上平台实验，结果显示，各组小鼠寻找平台潜伏期(见图2A)和平均游泳速度(见图2B)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

图2 各组小鼠水上平台实验比较(A为各组小鼠找到水上平台的时间；B为各组小鼠游泳速度)

2.2 各组小鼠Y迷宫实验比较 各组小鼠8 min进臂总次数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与SAMR1组小鼠比较，SAMP8组小鼠进臂正确率明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与SAMP8组小鼠比较，DSS 60 g/kg组小鼠进臂正确率明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图3。

与SAMR1组比较，＊ P<0.05；与SAMP8组比较，# P<0.05。图3 各组小鼠Y迷宫实验比较(A为各组小鼠总的进臂次数；B为各组小鼠进臂正确率)

2.3 各组小鼠神经炎性因子水平比较 与SAMR1组小鼠比较，SAMP8组小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与SAMP8组小鼠比较，DSS 60 g/kg组小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图4。

与SAMR1组比较，＊ P<0.05；与SAMP8组比较，# P<0.05。图4 各组小鼠海马组织中神经炎性因子水平比较(A为IL-1β变化；B为TNF-α变化；C为IL-6变化)

3 讨 论

β淀粉样蛋白沉积形成老年斑是阿尔茨海默病最主要的病理学特征。研究发现，脑内高淀粉样蛋白水平与早期阿尔茨海默病密切相关[11-12]。β淀粉样蛋白是由细胞膜上淀粉样前体蛋白发生异常剪切和错误折叠而产生的[13-14]。在阿尔茨海默病病人体内，β淀粉样前体蛋白经过β分泌酶裂解在细胞膜上产生含有99个氨基酸残基的胞外片段，此片段包含了完整的β淀粉样蛋白肽，经γ分泌酶裂解，产生具有致病作用的β淀粉样蛋白，β淀粉样前体蛋白经过γ分泌酶剪切后产生不同长度的β淀粉样蛋白残基，其中40和42个氨基酸残基最多，后者更容易沉积，是形成老年斑的主要物质[15]。在脑内，特别是大脑皮层、海马区β淀粉样蛋白沉积能自发地形成β折叠结构，这些β折叠进一步堆积就形成了脑中的淀粉样老年斑，导致突触损伤和神经元丢失[16]。

长期慢性炎症与β淀粉样蛋白毒性作用共同损伤神经系统，促进阿尔茨海默病的发展。其中，IL-1β信号通路在阿尔茨海默病中发挥致病作用[17-18]。IL-1β主要通过促进β淀粉样蛋白聚积和神经原纤维缠结参与阿尔茨海默病的致病过程，IL-1β在淀粉样斑块形成的早期过度表达，通过蛋白激酶C途径促进β淀粉样前体蛋白的合成、分泌，从而促进β淀粉样蛋白的沉积，β淀粉样蛋白可以激活小胶质细胞，而活化的小胶质细胞可以产生IL-1β等大量细胞因子，IL-1β可通过旁分泌作用激活星形胶质细胞，使其产生一氧化氮(NO)、IL-6、TNF和载脂蛋白E(ApoE)等，这些产物本身不仅可以造成神经元损伤、参与淀粉样斑块的形成，而且可以进一步激活小胶质细胞，从而产生更多的IL-1β等细胞因子，形成恶性循环[19]。当归芍药散主要由当归、芍药、川芎、茯苓、白术和泽泻6味药组成。其中芍药(白芍)养血、川芎活血、当归兼备活血养血，配以茯苓、白术、泽泻健脾渗湿，诸药合用具有补血活血化瘀、健脾利湿化痰的功效，既补中寓泻，又泻中求补，既益气养血，又化痰逐瘀，切中虚、痰、瘀。现代网络药理学研究显示，当归芍药散治疗阿尔茨海默病可能与其调节炎症、免疫系统、钙信号、细胞与细胞之间的信号交流等机制有关[20]。本研究结果显示，当归芍药散能缓解SAMP8小鼠的学习和记忆功能，其机制可能与其降低SAMP8小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平有关。