血浆miR-378、HSF1与慢性心力衰竭病人左心室重构的相关性分析

朱辰蕊，高竞生

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是指由于心肌梗死、心肌病或血流动力学负荷过重等原因造成心肌损伤，引起心肌结构和功能的改变，最后导致心室泵血或充盈功能低下的临床综合征，临床表现为呼吸困难、咳嗽和液体潴留[1]。研究发现，心室重构在CHF的发生、发展和临床转归中发挥重要作用[2]。临床上虽然可以通过彩色超声多普勒评价心室重构、心功能，但其反映的是心脏形态学指标的变化，无法反映CHF的致病原因。因此，探究影响CHF发生左心室重构(left ventricular remodeling，LVR)的影响因素并分析该因素与左心室重构的相关性，可能对深入了解CHF合并左心室重构具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种小分子的非编码RNA，可以通过抑制翻译、诱导降解等方式参与多种基因调控的表达[3]。研究发现，miRNA-378是心肌肥大的调节剂，通过在不同水平上抑制促分裂原活化蛋白激酶信号途径发挥其活性，并对心脏产生明显的抗纤维化作用[4]。热休克转录因子1(heat shock transcription factor 1，HSF1)是一种心脏保护因子，可减轻心脏肥大和心肌纤维化，并抵抗缺血损伤和心脏压力超负荷[5]。本研究通过检测CHF合并左心室重构病人血浆miR-378、HSF1水平，分析二者与CHF病人左心室重构的相关性，以期为临床预防、延缓CHF病人左心室重构提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2017年5月—2019年5月于唐山市开滦总医院心内科住院治疗的CHF病人137例作为CHF组，其中男71例，女66例，年龄40～74(55.18±8.22)岁。诊断标准：符合《2016年欧洲心脏病学会急慢性心力衰竭诊断与治疗指南》中的诊断标准[6]。依据美国纽约心脏病协会(New York Heart Association，NYHA)心功能分级[7]标准对CHF病人进行分级，其中Ⅰ级或Ⅱ级45例，Ⅲ级50例，Ⅳ级42例。另选取同期因急性心肌梗死于本院住院治疗的病人60例作为对照组，其中男32例，女28例，年龄43～70(55.36±8.51)岁。两组年龄、性别构成比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院医学伦理委员会批准并通过后实施，病人及家属均知情同意并签署知情同意书，研究方法符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①具有完整的诊断资料且病情诊断明确；②自愿参与且中途无退出研究者。排除标准：①曾行冠状动脉支架植入等心脏手术者；②严重肝、肾功能不全者；③合并急、慢性感染病者；④自身免疫性疾病者；⑤复发、难治性室性心律失常者。

1.3 主要试剂与仪器 总RNA提取试剂(Trizol试剂)(货号：MN562J2)、逆转录试剂盒(货号：J6547M)、实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)试剂盒(货号：N5643MJ)均购自美国Sigma公司；逆转录PrimeScript RT试剂盒(货号：ND6527J)、SYBR Premix ExTaq试剂盒(货号：GH8935K)均购自苏州泓迅生物科技股份有限公司；miR-378及内参U6引物由上海生工生物工程有限公司合成；人HSF1酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(货号：QCH0905)购自上海钦诚生物科技有限公司；qRT-PCR分析仪(型号：YFGB1022)购自日本Olympus公司；彩色多普勒超声心动仪(型号：HP-Sonos5500型)购自美国惠普公司。

1.4 方法

1.4.1 血浆样本的采集与保存 所有病人均于入院后抽取肘静脉血5 mL，置于含枸橼酸钠抗凝剂的抽血管内上下颠倒混匀，静置30 min，室温条件下3 000 r/min，离心15 min，吸取上清液分别装入EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.4.2 血浆HSF1水平检测 从-80 ℃冰箱中取出冻存血浆样本，解冻，采用ELISA法测定血浆HSF1的水平。所有操作均严格按照仪器和试剂盒说明书进行。

1.4.3 血浆miR-378表达水平检测 qRT-PCR法测定血浆miR-378表达水平。按照RNA试剂盒说明书提取总RNA，参照反转录试剂盒说明将RNA反转录为cDNA。参照实时荧光定量PCR试剂盒说明进行实时荧光定量PCR反应，引物序列见表1。反应体系为20 靗：SYBR Premix 10 靗，cDNA 1 靗，H2O 8 靗，正、反向引物各0.5 靗。反应程序：95 ℃预处理20 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40个循环。以U6作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算血浆miR-378相对表达水平。

表1 miR-378、U6引物序列(5′-3′)

1.4.4 超声心动图检查 病人左侧卧位，连接心电图，根据美国超声心动图学会推荐的方法对反映病人心室重构的指标进行检测[8]，测定并记录左心室重量指数(left ventricular mass index，LVMI)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume，LVEDV)、室间隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWT)、左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)。根据Devereux等[9]公式计算，LVMI=左室质量(logical volume manager，LVM)/体表面积(body surface area，BSA)，其中LVM=1.04[(IVST+LVPWT+LVEDD)3-LVEDD3]-13.6，BSA=0.006 1×身高(cm)+0.012 8×体重(kg)-0.152 9。所有参数均测量5个心动周期，取其均值。

2 结 果

2.1 两组血浆miR-378、HSF1水平比较 与对照组比较，CHF组心功能Ⅰ级或Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级病人血浆miR-378、HSF1水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Ⅰ级或Ⅱ级病人比较，CHF组心功能Ⅲ级、Ⅳ级病人血浆miR-378、HSF1水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Ⅲ级病人比较，CHF组心功能Ⅳ级病人血浆miR-378、HSF1水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 两组血浆miR-378、HSF1水平比较(±s)

2.2 两组超声心动图左心室重构指标LVMI、LVEF、LVEDV水平比较 与对照组比较，CHF组心功能Ⅰ级或Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级病人LVMI、LVEDV水平明显升高，LVEF水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Ⅰ级或Ⅱ级病人比较，CHF组心功能Ⅲ级、Ⅳ级病人LVMI、LVEDV水平明显升高，LVEF水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Ⅲ级病人比较，CHF组心功能Ⅳ级病人LVMI、LVEDV水平明显升高，LVEF水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 两组超声心动图左心室重构指标LVMI、LVEF、LVEDV水平比较(±s)

2.3 血浆miR-378、HSF1水平与左心室重构指标LVMI、LVEF、LVEDV的相关性分析 Pearson法分析相关性显示，CHF组病人血浆miR-378、HSF1水平与LVMI、LVEDV呈负相关(P<0.05)，与LVEF呈正相关(P<0.05)。详见表4。

表4 血浆miR-378、HSF1水平与左心室重构指标LVMI、LVEF、LVEDV的相关性(r值)

2.4 CHF病人左心室重构指标LVMI多元线性逐步回归模型分析 以CHF病人左心室重构敏感指标LVMI值为因变量，以血浆miR-378、HSF1为自变量，进行多元线性逐步回归分析。结果显示，血浆miR-378、HSF1是LVMI的影响因素(P<0.05)。详见表5。

表5 CHF病人左心室重构指标LVMI多元线性逐步回归模型分析

3 讨 论

CHF是一种以心脏结构改变或功能异常造成心室充盈和射血能力降低的复杂临床综合征，尤其是老年人群发病率较高，一般病程较长。心室重构是心肌细胞和细胞间基质成分在特定刺激下发生的心室僵硬度增加、心肌收缩力降低的变化，是CHF的重要临床病理基础[10]。心力衰竭长期预后较差，给病人及其家庭带来沉重的经济负担。因此，探究心力衰竭的致病因素对疾病的早期诊断和防治具有重要意义。

miRNA是真核生物体内一类约有22个核苷酸组成的非编码小分子RNA，通过碱基互补配对与靶基因mRNA的3′端非编码区结合，促进靶基因的降解或抑制转录后翻译[11]。研究发现，肾脏同种异体移植功能障碍的典型特征是肾间质纤维化，可能是由于肾移植过程中的缺血再灌注损伤引起，miRNA-378是一种促血管生成因子，可预防肾移植过程中的缺血再灌注损伤[12]。近年来研究发现，miRNA-378与心血管疾病密切相关，如与野生型小鼠相比，miRNA-378基因敲除小鼠表现出严重的心脏纤维化，从而应对胸主动脉收缩引起的心脏超负荷[13]。HSF1是热应激后激活的热休克基因的转录因子，可以和多种热休克蛋白结合形成非活性单体存在于细胞质中。在运动引起的心脏肥大人群中HSF1的激活被抑制，导致心脏出现严重的损伤，这一过程被证明是从适应性心脏肥大过渡为适应性不良性心力衰竭的关键因素[14]。研究证明，持续的压力过载可诱发不良心脏重塑并伴随心肌肥大和纤维化，最终导致收缩功能障碍和心脏衰竭，心脏纤维化可以导致适应不良性左心室重构，其特征是成纤维细胞的积累和细胞外基质蛋白的过量沉积，过度的心肌纤维化是心脏重构和心力衰竭发展的主要病理过程[15]，因此，预防其发生很重要。本研究发现，与对照组比较，CHF组心功能Ⅰ级或Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级组病人血浆miR-378、HSF1水平依次降低，提示血浆miR-378、HSF1水平降低与CHF并发左心室重构的发生发展有关，随疾病进展其表达水平明显改变。

LVMI、LVEF、LVEDV是评价左心室的质量的重要参数，其中LVEF是指每搏心输出量占左心室舒张末容量的百分数，也是临床心脏影像学最重要且最常用的参数，与心脏病的死亡率密切相关，可以预测愈后，衡量治疗效果，是心脏病诊断治疗的最重要指标[16]。本研究发现，与对照组比较，CHF组心功能Ⅰ级或Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级病人LVMI、LVEDV水平依次升高，LVEF水平依次降低，提示CHF合并左心室重构病人随心功能等级的增加，心脏发生了更严重的心室重构，并伴随严重的心脏收缩功能降低和心功能障碍。进一步经Pearson法分析显示，CHF组病人血浆miR-378、HSF1水平与LVMI、LVEDV呈负相关，与LVEF呈正相关，提示血浆miR-378、HSF1水平降低可能在心室重构过程中发挥重要作用，但其具体机制有待进一步研究。本研究对CHF合并左心室重构病人LVMI值进行多元线性逐步回归模型分析，血浆miR-378、HSF1对LVMI值有影响(P<0.05)。提示血浆miR-378、HSF1水平降低与CHF病人心室重构及心功能损伤有关，可能作为反映CHF病人心室重构及心功能损伤的重要指标，对临床评估CHF病人心室重构有一定意义。

综上所述，血浆miR-378、HSF1水平降低可能与CHF病人左心室重构的发生发展有关，可作为临床诊断CHF病人发生左心室重构及评估病情严重程度潜在标志物。但本研究仍存在不足：未选取体检正常人群作为健康对照组进行分析，下一步将增加此类人群作为观察对象，进一步分析血浆miR-378、HSF1与慢性心力衰竭病人左心室重构的关系，以得到更加可靠的结论；本研究并未对血浆miR-378、HSF1的相互作用进行研究，二者可能存在调控关系，今后需进行进一步的深入研究。