活血荣络方对大鼠脑缺血再灌注细胞凋亡的影响

王洪海，周颖璨，周德生，刘利娟

近年来，我国脑卒中患病率呈整体上升趋势且趋于年轻化，是目前我国成人致死、致残的首位病因[1]，其中以缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)发病为主，治疗该病的关键在于尽早开通阻塞血管，挽救缺血半暗带，但脑缺血再灌注后可加重脑组织损伤，且细胞凋亡在该病的病理生理过程中具有重要作用[2]。活血荣络方为周德生导师临床经验方，前期实验表明，活血荣络方可通过抑制Janus激酶2/信号转导与转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路，调节白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达，对脑缺血再灌注后损伤具有保护作用[3]，促进脑梗死血管再生[4]。本研究采用线栓法制备局灶性大脑中动脉脑缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，采用活血荣络方干预，通过免疫组化检查脑缺血再灌注后患侧脑组织中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)水平及神经功能缺损评分，旨在探讨活血荣络方对脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级健康雄性SD大鼠72只，体质量(250±20)g，购自湖南斯莱克景达实验有限公司，许可证号：SYXK(湘)2013-0005，饲养于湖南中医药大学SPF级动物实验中心。本研究中动物实验室护理及使用完全遵照1986年英国颁布《动物科学实验法》。

1.2 主要试剂及药物

1.2.1 主要试剂 通用型二步法检测试剂盒(购自北京中杉金桥生物公司；编号K152318A)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(购自武汉博士德生物公司；编号AR1022)，兔抗鼠Bax、Bcl-2多克隆抗体(购自武汉博士德生物公司，编号分别为BA0315-1、BA0412)。

1.2.2 活血荣络方浸膏制作 鸡血藤600 g，石楠藤600 g，生地黄300 g，玄参200 g，黄精300 g，乳香(研末)200 g，没药(研末)200 g，川芎200 g生药，经提取、浓缩后药液重量为1 923 g，每克含生药量1.352 g，于4 ℃冰箱保存备用。以上药物均购自湖南中医药大学第一附属医院门诊中药房。灌胃前根据人动物体表面积换算法，将浓缩药液用蒸馏水稀释1 mL含生药1.1 g的药液，置于4 ℃冰箱备用。

1.3 主要仪器 旋转蒸发仪(购自杭州大卫科教仪器有限公司)、Leica RM2235手动轮转石腊切片机(购自德国Leica公司)、MIAS医学图像分析系统(购自上海精宏实验设备有限公司)、oticam Pro 285A数码显微系统(购自麦克奥迪实业集团公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型制备及分组 实验动物分为造模组和假手术组。造模组参考Longa等[5]线栓法制备局灶性MCAO模型，插线深度为18～20 mm，约2 h后拔出线栓(即再灌注)。造模术后，待大鼠清醒后采用Bederson法[6]进行神经功能缺损评分，评分1～3分为造模成功判定标准；然后根据神经功能缺损评分，分别将评分为1分、2分、3分的大鼠随机分为模型组和活血荣络组，每组根据再灌注时间分为再灌注后6 h、12 h、24 h、72 h亚组，每个亚组6只，若造模大鼠术后出现癫痫、死亡或取脑组织时引起脑出血等影响实验指标观察事件，则排除，继续造模填补。同时,随机挑选24只SD大鼠为假手术组，具体操作同MCAO模型制作，仅插线深度控制在8～10 mm(栓塞颈内动脉)，拔线时间同模型组。

1.4.2 动物给药 造模成功后，假手术组、模型组均以等剂量蒸馏水灌胃，活血荣络组以配制好的活血荣络方浸膏稀释液1 mL/100 g灌胃，12 h灌胃1次，其余各组均以相应时间点灌胃相同剂量的蒸馏水。各组动物给药后均自由进食水、活动。

1.4.3 神经功能缺损评分 采用Bederson法[6]对所有实验大鼠术后2 h及再灌注后6 h、12 h、24 h、72 h进行神经功能缺损评分，具体评分如下：神经功能正常计0分；提大鼠尾巴至大鼠离桌面10～15 cm，不能完全伸展病灶对侧前爪计1分；置大鼠于水平地板时，向病灶对侧转圈计2分；置大鼠于水平地板时，向病灶对侧倾倒计3分；置大鼠于水平地板时，软瘫而无自发活动，或意识障碍计4分。

1.4.4 Bax、Bcl-2蛋白水平检测 再灌注后6 h、12 h、24 h、72 h时间点将大鼠麻醉成功后，予4%多聚甲醛充分灌注，立即断头取脑，置于4%多聚甲醛液中固定；3 d后制作脑组织蜡块，然后采用免疫组化检测。在×400光镜下观察切片，运用MIAS医学图像系统处理，计算灰度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠不同时间点神经功能缺损评分比较 假手术组神经功能缺损评分在各个时间点均为0分，故不做比较。模型组神经功能缺损评分在再灌注后24 h达高峰，72 h下降，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。活血荣络组神经功能缺损评分在再灌注后12 h达峰值，24 h下降，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。活血荣络组神经功能缺损评分在再灌注后24 h、72 h低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。各组间经重复测量方差分析，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠不同时间点神经功能缺损评分比较(±s) 单位：分

2.2 各组大鼠脑组织Bax、Bcl-2蛋白表达比较 大鼠脑缺血再灌注后脑组织Bax、Bcl-2蛋白表达在光镜下(×400)为黄棕色，通过MIAS医学图像系统处理计算的灰度值与目标蛋白表达量成反比。假手术组不同时间Bax、Bcl-2蛋白表达无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组Bax、Bcl-2蛋白表达在再灌注后24 h达峰值、72 h下降，除再灌注后12 h与72 h组内比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余时间组内比较，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。活血荣络组Bax蛋白表达在再灌注后72 h内呈下降趋势，组内比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；Bcl-2蛋白表达在再灌注后24 h内呈上升趋势、72 h时降低，除再灌注后12 h与72 h组内比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余时间组内比较，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。模型组、活血荣络组Bax、Bcl-2蛋白表达在各个时间点均高于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.01)。活血荣络组Bax蛋白表达在再灌注后12 h、24 h、72 h时低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.01)；而Bcl-2蛋白表达在各个时间点均高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表2～表3、图1～图2。

表2 各组大鼠脑梗死病灶周围脑组织Bax蛋白表达灰度值比较(±s)

表3 各组大鼠脑梗死病灶周围脑组织Bcl-2蛋白表达灰度值比较(±s)

图1 各组不同时间Bax蛋白表达(×400)

图2 各组不同时间点Bcl-2蛋白表达(×400)

3 讨 论

缺血性脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高等特征，对病人日常生活造成严重影响，给病人家庭及社会带来一定负担，故缺血性脑卒中一直成为神经内科研究的热点[1]。成熟脑神经元不可再生，故强调“时间就是大脑，时间就是生命”，早期开通阻塞血管成为治疗该病的关键，但研究指出脑缺血再灌注时可加重细胞损伤，导致细胞凋亡，影响缺损神经功能恢复[7]；可能与兴奋性氨基酸/氧自由基、钙超载、内质网应激反应、炎症反应、线粒体损伤、凋亡基因调控等机制相关[7-10]。如何抑制脑缺血再灌注后所致的神经元凋亡成为恢复缺损神经功能的重要因素。中医药通过多靶点、多途径防治缺血性脑卒中疗效显著，其根本治疗在于活血化瘀通络、调畅全身气机[11-12]。

缺血性脑卒中可归属中医“中风病”范畴。《黄帝内经》认为：人之一身，体阴而用阳，阴不足而阳常有余；年四十后阴气自半也，并逐渐发展为阴痿。津血同源，阴虚则血虚，血虚则脉失所养，脉失濡养则脉涩，脉涩则血瘀。故老年病人多伴阴虚血瘀。中风发病之初多由气、火、痰、瘀等有形之邪停聚脑脉，闭阻经脉，引起脏腑功能失和、气血失调，导致脑络失荣养而发病[13]。加之缺血性脑卒中病人多为老年病人，多伴阴虚血瘀，故导师周德生基于“内虚邪中学说”，融合痰、瘀、火、气等内风诸说，拓展阴虚血瘀说，进而确立“荣气虚滞说”，故采用活血荣络方以滋阴活血荣络。方中鸡血藤、石楠藤为君药，滋阴活血通络；生地黄、玄参、黄精为臣药，助君药滋阴活血；乳香、没药为佐药，加强活血通络；川芎为使药，载药周流全身，通调气血。纵观全方，滋补阴血同时重活血通络，防止滋腻过剩而阻碍气血运行；兼以辛温芳香之品，鼓动气血，促进活血化瘀[14]。

Bax、Bcl-2是Bcl-2基因家族中调控细胞凋亡的基因之一，Bax促进细胞凋亡，Bcl-2抑制细胞凋亡[15]。实验研究表明，缺血性神经损伤过程中存在细胞凋亡，启动细胞凋亡基因，同时也启动抑制细胞凋亡基因[16-18]。本研究各组大鼠经神经功能缺损评分后发现，活血荣络组在再灌注后24 h后低于模型组，提示活血荣络方对脑缺血再灌注后促进缺损神经功能恢复的作用。模型组在脑缺血再灌注后24 h时Bax、Bcl-2蛋白表达呈峰值、72 h下降；活血荣络组Bax蛋白表达在再灌注后12 h、24 h、72 h时低于模型组(P<0.01)，而Bcl-2蛋白表达在各个时间点均高于模型组(P<0.01)。提示SD大鼠脑缺血再灌注后脑组织中Bax、Bcl-2蛋白表达明显增加，活血荣络方能下调Bax/Bcl-2水平，抑制细胞凋亡，恢复缺损神经功能。

综上所述，细胞凋亡与脑缺血再灌注后存在密切关系。脑缺血再灌注后Bax、Bcl-2蛋白表达增加；活血荣络方能抑制Bax蛋白表达、促进Bcl-2蛋白表达，抑制细胞凋亡，促进缺损神经功能恢复。JAK2/STAT3信号通路在脑缺血再灌注损伤中扮演重要角色[19]；结合前期研究活血荣络方通过抑制JAK2/STAT3信号通路，调节脑缺血再灌注后炎症水平，本团队在后续的研究中将探讨活血荣络方关于脑缺血再灌注后JAK2/STAT3信号通络与细胞凋亡否具有相关性，进一步阐明活血荣络方治疗脑梗死的机制，以期更有利于服务临床。