柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆与表达分析

邹晓燕， 王林杰， 黄 杰， 罗丽娟， 刘国道， 陈志坚,*

(1. 海南大学热带作物学院， 海南 海口 570228； 2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部华南作物基因资源与种质创制重点实验室， 海南 海口 571101)

金属元素铁、锰、铜和锌等，是植物生长所必需的微量营养元素，它们在植物生长发育过程中起重要作用。微量元素缺乏会影响植物代谢酶活性，导致叶片失绿和植株矮小等现象[1]。然而，金属元素的过量积累也会破坏细胞结构，造成代谢紊乱[2]。另外，过量的金属元素可能会通过食物链进入人体，影响人类健康。因此，微量营养元素的过量与缺失均会降低作物的产量和品质，是农业生产中亟待解决的问题。

植物可以通过多种金属转运蛋白来调节养分的吸收、转运和分配，从而维持细胞矿质营养平衡[3]。其中，植物天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)是一类具有保守结构和功能的大家族蛋白，参与了多种金属离子的吸收和转运，如锰、铁、镉和铝等金属离子[4]。研究人员首次在小鼠中克隆了Nramp蛋白[5]，随后在细菌、动物和植物中也相继报道了Nramp同源蛋白的生物学功能。据报道，拟南芥(Arabidopsisthaliana)包含有6个Nramp蛋白成员，其中，AtNramp1定位于质膜和胞内囊泡，参与了细胞锰离子的转运及维持铁离子的稳态[6]。AtNramp2定位于高尔基体，具有调控锰离子再分配的功能[7]。AtNramp3和AtNramp4定位于液泡膜，分别参与了锰和铁离子的转运[8]，而AtNramp6定位在囊泡，具有转运镉的功能[9]。在水稻(Oryzasativa)中，7个Nramp蛋白均定位于细胞质膜上[10-11]。OsNramp1主要在根中表达，参与水稻铁、镉和砷的转运[12-13]。OsNramp3主要在茎节维管束中表达，是地上部锰分配的重要调节因子[11,14]。OsNramp4是水稻根系吸收铝离子的转运蛋白[15]。OsNramp5主要在根中表达，主要参与了水稻对锰和镉的吸收[10,16]，而OsNramp6主要在幼叶中表达，参与了铁、锰和镉的转运[17]。因此，Nramp蛋白成员具有运输金属离子的保守功能。

柱花草(Stylosanthesguianensis)是豆科蝶形花亚科的一个属，大多数种起源于巴西和哥伦比亚等热带国家和地区。柱花草因其适应性强，产量高，在世界热带地区被广泛用作牧草饲料喂养牲畜，并用于豆科绿肥和林果草生态工程建设等[18]。柱花草对土壤缺磷胁迫、铝和锰金属元素毒害表现出良好的耐受性，已成为热带牧草生理生态研究的重要植物之一。以往研究主要从生理和代谢途径等方面探索了柱花草适应元素胁迫的机理[19-21]，对柱花草金属转运蛋白的克隆及表达分析的研究未见报道。因此，本研究克隆了柱花草Nramp家族成员SgNramp1和SgNramp2基因，并对其进行了生物信息学和基因表达分析，旨在为后续深入分析柱花草SgNramp家族基因的生物学功能提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用试验材料为‘热研5号’圭亚那柱花草(Stylosanthesguianensis)，种子保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所热带牧草研究室。

1.2 试验方法

1.2.1柱花草培养及处理 参考贾怡丹等(2020)方法[22]，将萌发3 d后的柱花草幼苗转移至Hoagland营养液(pH5.8)中进行培养，营养液包含1 500 μmol·L-1KNO3，400 μmol·L-1NH4NO3，300 μmol·L-1(NH4)2SO4，0.16 μmol·L-1(NH4)5MoO24·4H2O，1 200 μmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，250 μmol·L-1KH2PO4，25 μmol·L-1MgCl2·6H2O，500 μmol·L-1MgSO4·7H2O，300 μmol·L-1K2SO4，1.5 μmol·L-1MnSO4·H2O，1.5 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.5 μmol·L-1CuSO4·5H20，40 μmol·L-1Fe-EDTA(Na)和2.5 μmol·L-1NaB4O7·10H2O。柱花草正常培养14 d后，分别进行以下处理：缺锰(-Mn)，缺铁(-Fe)，缺铜(-Cu)和缺锌(-Zn)处理，以全营养液为对照处理，处理液pH为5.8；过量锰(400 μmol·L-1Mn)，铁(800 μmol·L-1Fe)，铜(10 μmol·L-1Cu)和锌(20 μmol·L-1Zn)处理，以全营养液为对照处理，处理液pH为5.0。每个处理设置三个生物学重复，处理期间每隔7 d更换一次营养液。处理14 d后，收获植株样品，用于RNA提取及基因表达分析。另外，柱花草在含有0(CK)，100 μmol·L-1AlCl3，40 μmol·L-1CdCl2和20 μmol·L-1LaCl2的500 μmol·L-1CaCl2溶液(pH4.5)中处理24 h后，收获根系样品，用于RNA提取及基因表达分析。

1.2.2RNA提取和cDNA合成 参照黄杰等[23]方法提取柱花草RNA。称取0.1 g样品，加入1 mL TRIzol提取液，充分研磨，4℃下12 000 rpm离心3 min，吸上清至新离心管中。加入氯化钠(5 mol·L-1)和2/3体积氯仿，充分混匀。4℃下12 000 rpm离心10 min，取上清至新离心管中，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10 min。4℃下12 000 rpm离心10 min，弃上清液，加入1 mL 75%乙醇。4℃下7 500 rpm离心2 min，弃上清，加入1 mL无水乙醇。4℃下7 500 rpm离心2 min，弃上清，风干沉淀，加入无RNase ddH2O溶解RNA。cDNA合成参考HiScript III 1 st Strand cDNA Synthesie Kit试剂盒(Vazyme，中国)方法。反应体系及程序为：加入5 μL RNase ddH2O，3 μL Total RNA，65℃反应5 min，迅速置于冰上；加入2 μL 5×gDNA wiper Mix，充分混匀，42℃反应2 min；加入2 μL 10×RT Mix，2 μL HiScript III Enzyme Mix，1 μL Oligo(dT)20，5 μL RNase ddH2O，充分混匀后，25℃反应5 min，37℃反应45 min，85℃反应5 sec。cDNA于-80℃保存备用。

1.2.3柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆 根据本实验室前期柱花草全长转录组结果，筛选得到SgNramp1和SgNramp2基因全长cDNA序列。根据序列信息，设计基因特异引物SgNramp1-ORF-F/R和SgNramp2-ORF-F/R(表1)。以根系cDNA为模板，进行PCR扩增得到SgNramp1和SgNramp2基因。将PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，中国)上，并进行测序分析。

表1 SgNramp1和SgNramp2基因全长克隆和定量PCR引物Table 1 Primers for SgNramp1 and SgNramp2 full-length cloning and qRT-PCR analysis

1.2.4SgNramp1和SgNramp2基因生物信息学分析 利用EXPASY(https://web.expasy.org/protparam/)在线工具分析基因的氨基酸数、分子量和等电点；通过HMMTOP(http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)进行亚细胞定位预测分析；通过HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)进行蛋白保守结构域预测和跨膜结构域分析；使用MAGA-X并结合EvolView(https://www.evolgenius.info/evolview/#login)构建系统进化树。

1.2.5SgNramp1和SgNramp2基因表达分析 使用QuantStudioTMReal-Time PCR(Thermo Fisher，美国)系统和SYBR Green(Vazyme，中国)定量试剂盒进行实时定量PCR(qRT-PCR)分析。定量PCR反应体系包括10 μL 2×SYBR Green PCR master mix，2 μL cDNA模板(稀释倍数50)、1 μL引物(10 μmol·L-1)，并补足ddH2O至20 μL；反应程序为：95℃ 1 min，95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，40个循环。基因相对表达量为目的基因表达量除以内参基因(SgEF1a)表达量。

1.2.6数据统计分析 数据采用Microsoft Excel 2010进行分析和作图，并用软件SPSS v23.0(SPSS Institute，美国)进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆

本研究根据柱花草全长转录组测序结果获得的SgNramp1和SgNramp2基因全长序列，设计基因全长克隆引物，以柱花草根系cDNA为模板，扩增出SgNramp1和SgNramp2基因cDNA全长序列。SgNramp1基因全长为1 654 bp，而SgNramp2基因全长为1 716 bp(图1)。

图1 SgNramp1和SgNramp2全长cDNA的克隆Fig.1 Full lengths cloning of SgNramp1 and SgNramp2 注：Marker，DL2000 DNA Marker；1，柱花草SgNramp1基因扩增产物；2，柱花草SgNramp2基因扩增产物Note:Maker,DL2000 DNA maker;1,PCR product of SgNramp1;2,PCR product of SgNramp2

2.2 SgNramp1和SgNramp2蛋白特性分析

利用Expasy在线工具分析表明SgNramp1和SgNramp2蛋白分别包含有544和557个氨基酸，分子量分别为59.5 kDa和61.0 kDa，等电点分别为8.2和5.2。亚细胞定位预测分析发现两个蛋白都定位在细胞质膜上，可能为膜蛋白。

2.3 SgNramp1和SgNramp2蛋白保守结构域分析

利用HMMER对SgNramp1和SgNramp2蛋白进行保守结构域分析，结果表明SgNramp1和SgNramp2均属于Nramp蛋白家族成员，均包含有Nramp蛋白SLC5-6-like_sbd superfamily保守序列，且包含有12个跨膜结构域(图2)。

图2 SgNramp1 (A) 和SgNramp2 (B) 蛋白保守结构域分析Fig.2 Analysis of conserved domains of SgNramp1 (A) and SgNramp2 (B)

2.4 系统进化树分析

系统进化树分析表明，拟南芥、水稻、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)和苜蓿(Medicagotruncatula)等不同植物的Nramp蛋白可以被分为3大组，并进一步被分为6个亚组(图3)。柱花草SgNramp1被分在第I组中，与拟南芥AtNramp1/6，水稻OsNramp3，大豆GmNramp5a/5b/6a/6b和苜蓿MtNramp1/6等Nramp蛋白同属一个亚组，且SgNramp1与大豆GmNramp5a/5b具有较高的同源性。SgNramp2被分在第II组，与拟南芥AtNramp2/5、大豆GmNramp4a/4b和苜蓿MtNramp3等Nramp蛋白同属一个亚组，且SgNramp2与MtNramp3同源性最高(图3)。

图3 SgNramp1和SgNramp2与其他植物Nramps蛋白系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis of SgNramp1 and SgNramp2 with other Nramp proteins注：At,拟南芥；Os,水稻；Hv,大麦；Cs,黄瓜；Mt,苜蓿；Zm,玉米；Gm,大豆；Pt,毛果杨；Sg,柱花草Nramps蛋白Note:At,Arabidopsis thaliana;Os,Oryza sativa;Hv,Hordeum vulgare;Cs,Cucumis sativus;Mt,Medicago truncatula;Zm,Zea mays;Gm,Glycine max;Pt,Populus trichocarpa;Sg,Stylosanthes guianensis

2.5 柱花草SgNramp1/2基因组织表达分析

本研究通过RT-PCR方法，分析了SgNramp1和SgNramp2基因在柱花草不同组织中的表达模式。由图4A和4B所示，SgNramp1基因在柱花草根中的表达量显著高于叶中的表达量(P<0.05)，而SgNramp2基因则在叶中特异性表达。另外，本研究也分析了SgNramp1/2在柱花草新叶(NL)、成熟叶(ML)和老叶(OL)中的表达。结果发现，SgNramp1基因在新叶中的表达量最高，成熟叶和老叶次之；然而，SgNramp2基因在老叶中的表达量显著高于新叶的表达量(P<0.05)(图4C和4D)。

图4 柱花草SgNramp1和SgNramp2基因组织表达分析Fig.4 Expressions of SgNramp1 and SgNramp2 in different tissues注：图中不同字母表示不同组织间差异显著(P<0.05)Note: Different letters indicate significant differences among different tissues at the 0.05 level

2.6 不同元素胁迫处理对SgNramp1/2基因的表达的影响

本研究分析了锰、铁、锌和铜等元素缺乏和过量胁迫处理对SgNramp1/2基因在柱花草叶和根中表达的影响。由图5可知，和CK相比，虽然SgNramp1/2基因对元素缺乏的响应不一样，但缺锰(-Mn)处理均显著抑制了SgNramp1/2基因在叶和根中的表达(P<0.001)。缺锌(-Zn)和铜(-Cu)处理增强了SgNramp1基因在根中的表达，但对SgNramp1基因在叶中的表达影响不显著(图5A,5B)。缺铁(-Fe)和-Cu处理增强了SgNramp2基因在叶中的表达，但-Mn，-Fe，-Zn和-Cu处理均抑制了SgNramp2基因在根中的表达(图5C,5D)。

图5 不同元素缺乏处理对SgNramp1和SgNramp2基因表达的影响Fig.5 Effects of element deficiency on SgNramp1 and SgNramp2 expressions 注：*表示不同处理与对照(CK)间差异显著(*, 0.01

由图6可知，元素过量胁迫对SgNramp1/2基因表达的调控有所差异。过量锰(+Mn)和锌(+Zn)处理显著增强了SgNramp1在叶中的表达(P<0.05)，而过量铁(+Fe)和+Zn处理则增强了SgNramp1在根中的表达(图6A,6B)。+Mn处理抑制了SgNramp2在叶中的表达，但却增强了SgNramp2在根中的表达；+Fe处理增强了SgNramp2在叶中的表达，而+Zn处理则增强了SgNramp2在根中的表达(图6C,D)。另外，过量铜(+Cu)处理均显著抑制了SgNramp1在叶和根中的表达(P<0.05)，但却增强了SgNramp2基因在叶和根中的表达(图6)。

图6 不同元素过量处理对SgNramp1和SgNramp2基因表达的影响Fig.6 Effects of excess elements on SgNramp1 and SgNramp2 expressions注：A和B，SgNramp1在叶(A)和根(B)中的表达量；C和D，SgNramp2在叶(C)和根(D)中的表达量。星号表示不同处理与对照(CK)间差异显著(*, 0.01

2.7 不同金属处理对SgNramp1/2基因表达的影响

本研究进一步分析了金属铝(100 μmol·L-1Al)、镉(40 μmol·L-1Cd)和镧(20 μmol·L-1La)处理对SgNramp1/2基因在柱花草根中表达的影响。由图7可知，SgNramp1/2基因对不同金属处理响应不一样。与对照CK相比，镉(Cd)处理显著增强了SgNramp1基因在根中的表达(P<0.001)，而铝(Al)和镧(La)处理则抑制了SgNramp1基因的表达(图7A)。然而，与对照CK相比，铝、镉和镧处理均增强了SgNramp2基因的表达，且SgNramp2基因在镉处理下表达量最高，铝和镧处理下次之(图7B)。

图7 不同重金属处理对SgNramp1(A)和SgNramp2(B)基因表达的影响Fig.7 Effects of heavy metal treatments on the expressions of SgNramp1 (A) and SgNramp2 (B)注：星号表示不同处理间差异显著(*, 0.01

3 讨论

细胞矿质营养平衡对维持植物生长和发育具有重要的影响，植物Nramp蛋白被报道在金属离子吸收、转运和分配过程中起重要作用[24]。研究表明，在拟南芥中，包括6个AtNramps蛋白[25]，在水稻中，包含7个OsNramps蛋白[10]，而在大豆中则包含13个GmNramps蛋白[24]。不同植物的Nramp蛋白家族成员具有高度保守的SLC5-6-like-sbd结构域，且一般具有10～12个跨膜结构域[24,26]。本研究发现，柱花草SgNramp1和SgNramp2也包含有Nramp蛋白SLC5-6-like_sbd superfamily保守序列，且均包含有12个跨膜结构域(图2)，表明SgNramp1和SgNramp2属于Nramp蛋白家族成员。并且，亚细胞定位预测表明SgNramp1和SgNramp2均定位在细胞质膜上，暗示其可能具有转运金属离子的功能。

不同植物的Nramp蛋白被报道参与了转运锰和铁等金属离子[4,24]。在系统进化树中，柱花草SgNramp1与拟南芥AtNramp1/6，水稻OsNramp3以及苜蓿MtNramp1/6等Nramp蛋白被分在第I大组中(图3)。研究发现，拟南芥AtNramp1蛋白定位在质膜中，nramp1突变体在缺锰条件下不能正常生长，且组织锰浓度低于野生型植株，进一步分析发现AtNramp1是负责拟南芥根系锰吸收的高亲和锰转运蛋白，并具有转运铁的能力[25]。另外，拟南芥AtNramp6被报道定位在囊泡内膜上，可能参与了镉的运输[9]。因此，柱花草SgNramp1可能具有与拟南芥AtNramp1/6类似的生物学功能，参与细胞锰和镉的转运。柱花草SgNramp2与拟南芥AtNramp2/5、大豆GmNramp3a/3b和苜蓿MtNramp3等同第II组。研究表明，拟南芥AtNramp2定位在高尔基体中，主要负责锰在高尔基体中的再分配，突变AtNramp2基因显著抑制了缺锰条件下拟南芥根系的生长[7]，这暗示了SgNramp2参与锰离子转运。

在本研究中，SgNramp1基因主要在柱花草根中表达，而SgNramp2基因则在叶中特异性表达，并且，SgNramp1基因在新叶中的表达量最高，而SgNramp2基因则在老叶中的表达量最高(图4)。AtNramp1在根部中的表达量高于地上部，且缺锰和缺铁胁迫均增强了拟南芥AtNramp1在根中表达，进一步分析发现AtNramp1主要负责根系对锰元素的吸收[25,27]，而AtNramp6则主要在叶中表达，参与了拟南芥对镉转运和积累[9]。在水稻中，OsNramp3主要在茎节中表达，是调节水稻地上部锰分配的重要基因[11]。在本研究中，缺锰处理抑制了SgNramp1基因在根和叶中的表达，而金属镉处理则增强了SgNramp1基因在根中的表达(图5和图7)，这些结果暗示了柱花草SgNramp1参与细胞锰和镉的转运。另外，本研究发现，缺铁处理增强了SgNramp2基因在叶中的表达，而铝和镉处理也增强了SgNramp2在根中的表达(图5和图7)。然而，与SgNramp2较同源的拟南芥AtNramp2主要在根部中表达，虽然AtNramp2表达量不受缺锰、缺铁和缺锌等胁迫的影响，但其具有调控锰离子再分配的生物学功能[7]。因此，SgNramp2可能具有与拟南芥AtNramp2不同的离子转运机制，其潜在的生物学功能仍需要进一步挖掘。

4 结论

综上所述，本研究克隆了柱花草SgNramp1和SgNramp2基因。结果发现柱花草SgNramp1和SgNramp2基因表达具有组织特异性，并且，SgNramp1和SgNramp2基因表达受到不同金属元素胁迫处理的调控，暗示其可能具有调节金属离子转运的功能。本研究为进一步挖掘SgNramp1和SgNramp2基因的生物学功能提供了研究方向及参考。