假地豆响应缺磷胁迫的代谢衍生物分析

朱厚荣, 郑韶爵, 吕金慧, 徐然然, 罗丽娟, 董荣书

(1. 海南大学热带作物学院， 海南 海口 570228； 2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所， 海南 海口 571101)

磷(Phosphorus,P)是植物生长所必需的大量营养元素之一，参与了光合作用、能量转换、生物大分子合成等生理生化过程[1]。可溶性无机磷(Pi)是植物可直接从土壤中吸收的主要磷源形式[2]。但是它很容易与土壤中的有机化合物、Al3+,Ca2+,Fe3+等金属阳离子相互作用形成不能被植物根系直接吸收的难溶性磷，导致土壤有效磷低，从而限制植物生长发育[3]。在农业生产中通过施用过量磷肥以满足农作物对磷的需求，但是磷肥在当季利用率低[4]。过量的磷肥会造成土壤退化、水体富营养化等环境问题[5]。因此，研究植物适应低磷胁迫机理并培育磷高效作物品种，对发展可持续农业具有重要意义。

为适应低磷胁迫环境，植物在进化过程中形成了一系列机制提高磷吸收和利用能力[6]。水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、紫花苜蓿(Medicagosativa)等植物通过调控根系形态，提高根系与土壤的接触面积，从而增强根系获取Pi的能力[7-9]。在低磷环境中，植物还通过调控有机酸、糖类、核苷酸等代谢物的积累提高对低磷胁迫的适应能力。例如，水稻和大豆在低磷胁迫下根系会合成大量的有机酸，通过根系分泌的有机酸溶解难溶性磷，从而提高土壤磷的利用能力。而且水稻根系分泌的半乳糖醛酸不断积累，降低了磷酸盐对土壤胶体的吸附，增加土壤中Pi的有效性[10-11]。此外，在低磷胁迫下，玉米(Zeamays)、大麦(Hordeumvulgare)和柱花草(Stylosanthesguianensis)会增强对衰老组织含磷代谢物(如：核苷酸等)的再活化利用，从而提高对有效磷的吸收能力[12-14]。

假地豆(Desmodiumheterocarpon)为豆科山蚂蝗属多年生亚灌木状草本，主要分布于我国南方各省区[15]。假地豆根系发达，对酸性缺磷土壤适应性强，是我国热带与亚热带地区重要的豆科牧草和绿肥资源[16-17]。目前国内外对假地豆的研究主要集中于生物学特性和药用价值，然而对其耐缺磷胁迫的潜在机理却鲜有报道。因此，本研究通过水培试验条件分析缺磷胁迫对假地豆生长和代谢积累的影响，为解析假地豆耐缺磷胁迫机理提供理论基础。目的是(1)探索缺磷胁迫下，假地豆的生物量和全磷含量产生哪些变化；(2)明确假地豆的代谢衍生物适应缺磷环境的机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料和培养条件

本试验所用假地豆(Desmodiumheterocarpon)种子(编号：151016001)由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。假地豆的水培试验方法如下：种子萌发后在1/2 Hoagland营养液预培养15 d。随后，挑选长势均一的幼苗分别移至含250 μmol·L-1KH2PO4(+P处理)和0 μmol·L-1KH2PO4(-P处理)的1/2 Hoagland营养液进行正常供磷和缺磷处理。每个处理设置5个生物学重复。分别在处理0 d，5 d，10 d和15 d时收取地上部和根部样品，用于测定生物量、根系性状、全磷含量。在15 d时收取所有叶片和根系鲜样，用液氮速冻后，于-80℃保存用于代谢组学分析。

1.2 试验方法

1.2.1干重和全磷含量测定 假地豆地上部和根部样品分别于收获后，置于烘箱中105℃杀青30 min，75℃烘干至恒重后称其干重。样品烘干粉碎后，称取0.05 g样品于灰化瓶中，加入适量浓硫酸和乙醇(5∶95，v/v)混合液浸湿样品，于马弗炉中600℃灰化10 h至无色，冷却后，加入8 mL 100 mmol·L-1HCl充分溶解48 h，参照Murphy和Riley[18]的钼锑抗显色法，测定OD700的吸光度值，计算全磷含量。

1.2.2叶片及根系性状分析 将假地豆整株展开，使用EPSON Expression 12 000 XL根系扫描仪扫描获取叶片和根系图像，再利用图像分析软件WINRHIZO(Regent Instruments Inc.，Canada)计算根系总根长、根表面积和根体积[19]。

1.2.3代谢组学分析 广泛靶向代谢组学分析委托深圳华大基因科技服务有限公司参照Chen等[20]的方法进行。检测代谢物的高效液相色谱-串联质谱联用仪(LC-MS/MS)为QTRAP 6500 plus(SCIEX,USA)。差异累积代谢物(Differential accumulation metabolites，DAMs)鉴定参考Thévenot等[21]的方法，根据OPLS-DA模型获得的变量重要性投影(Variable importance in project，VIP)评分，将VIP ≥1.0，差异倍数(Fold change，FC) ≥2或≤0.5的代谢物定义为DAMs。

1.3 数据统计分析

本研究相关数据采用Microsoft Excel 2016进行整理和可视化作图，数据结果以平均数和标准误(SE)表示，利用SPSS软件(V26.0，SPSS Institute，美国)对同一天假地豆不同磷浓度处理(+P和-P)下的指标进行独立样本T检验，分析其差异显著性。

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫对假地豆生长的影响

如图1所示，从处理第5 d开始，-P条件下假地豆的地上部干重和磷含量显著低于+P处理，而且随着处理时间的延长，两个处理间的差异逐渐增大，在15 d时，-P处理的地上部干重和磷含量分别比+P处理降低39.7%和94.6%，差异极显著(P<0.001)。第5 d时，根部干重在两个处理间无显著差异，但从第10 d开始，-P处理10 d和15 d的根部干重分别比+P处理显著增加101.5%和61.0%(P<0.001)(图1 D)。与地上部磷含量类似，-P处理5 d～15 d的根部磷含量均显著低于+P处理(P<0.001)(图1 E)。如图2所示，与+P处理相比，-P处理对根系生长具有促进作用。-P处理5 d～15 d的总根长、根表面积和根体积分别比+P处理显著增加36.6%～160.5%，22.3%～147.3%和28.1%～118.6%(P<0.001)。

图1 缺磷胁迫对假地豆干重和磷含量的影响Fig.1 Effects of P deficiency on dry weight and P content of D.heterocarpon注：(A)假地豆在两个磷处理下的生长表型；(B)地上部干重；(C)地上部磷含量；(D)根部干重；(E)根部磷含量。星号表示t-检验-P与+P处理之间差异显著，*:0.01≤P<0.05,**:0.001≤P<0.01,***:P<0.001，ns表示不显著。下同Note:(A) Growth phenotypes of D.heterocarpon under two P treatments;(B) Shoot dry weight;(C) P contentin shoot;(D) Root dry weight;(E) P contentin root. The asterisks indicate significant differences between -P and +P according to Student’s t-test,*:0.01≤P<0.05,**:0.001≤P<0.01,***:P<0.001,ns means not significant. The same as below

图2 缺磷胁迫对假地豆根系生长的影响Fig.2 Effects of P deficiency on root growth of D.heterocarpon注：(A)假地豆在两个磷处理下的根系形态；(B)总根长；(C)根表面积；(D)根体积Note:(A) Root morphology of D.heterocarpon under two P treatments;(B) Total root length;(C) Root surface area;(D) Root volume

2.2 假地豆响应低磷胁迫的代谢组学分析

如图3所示，基于LC-MS/MS的代谢组分析共检测到假地豆代谢物267种，其中叶片DAMs共79个(上调42个，下调37个)；根系DAMs共79个(上调48个，下调31个)。

图3 假地豆叶片(A)和根系(B)响应缺磷胁迫的代谢组学分析Fig.3 Metabolomics response to P deficiency in leaves (A) and roots (B) of D.heterocarpon注：红圈、绿圈和灰圈分别表示上调、下调和不显著代谢产物Note:Red circles,green circles and gray circles indicate up-regulated,down-regulated,and non significant metabolites,respectively

这些DAMs可被分为类黄酮、萜类、有机酸、氨基酸及其衍生物、苯丙素类、生物碱、酚类、核苷酸及其衍生物、聚酮类、糖及醇类、甾体类和维生素及其衍生物共12类(图4)。其中，在缺磷胁迫下，检测到的生物碱、聚酮类和糖及醇类代谢物在假地豆叶片和根系均全部上调(图4)。此外，检测到的有机酸在根系全部上调(图4)。

图4 假地豆响应缺磷胁迫的差异代谢物分类Fig.4 Classification of DAMs in response to P deficiency in D.heterocarpon注：L表示叶片的差异代谢物，R表示根系的差异代谢物。橙色和蓝色分别表示上调和下调的代谢物。数字表示该类代谢物个数Note:L denotes the differential metabolites of leaves,R denotes the differential metabolites of roots. Orange and blue bars indicate up-regulated and down-regulated metabolites,respectively. The number in the bar indicates the number of metabolites in the class

2.3 低磷胁迫导致假地豆的生物碱、聚酮类和糖及醇类显著积累

如图5所示，缺磷处理导致假地豆叶片和根系的2种生物碱(蝙蝠葛苏林碱和大麦芽碱)均显著上调。此外，延胡索乙素、虫草素、槐定碱、葫芦巴碱这4种生物碱在根系中受低磷胁迫诱导也显著增加(图5)。在糖及醇类中，水苏糖、麦芽糖醇、棉籽糖、葡萄糖醛酸内酯4种代谢物在缺磷处理的根系中显著上调，而叶片中只有L-亮氨醇受缺磷处理显著上调(图5)。对于聚酮类，缺磷处理使根系中大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、羟基茜草素和升麻素苷的积累显著提高，而-P处理的叶片中氧化白藜芦醇和番泻苷显著上调(图5)。

图5 低磷胁迫对假地豆生物碱、聚酮类、糖及醇类积累的影响Fig.5 Effect of P deficiency on the accumulation of alkaloids,polyketides,sugars and alcohols in D.heterocarpon注：红色和灰色分别表示差异代谢物显著上调和不显著。FC(-P/+P)表示代谢物在-P与+P处理下的差异倍数。下同Note:Red and grey indicate significantly up-regulated and insignificant differential metabolites,respectively. FC (-P/+P) indicates the ratio of relative levels of metabolites under -P to +P treatment. The same as below

2.4 低磷胁迫导致假地豆的原花青素、槲皮素及其衍生物显著积累

如图6所示，缺磷处理使假地豆叶片和根系的槲皮素及其2种衍生物(异槲皮苷和槲皮甙)均显著上调。此外，叶片中二氢槲皮素和槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷在缺磷处理条件下积累显著增加，而根系中槲皮万寿菊素7-O-葡萄糖苷受低磷条件诱导积累增加(图6)。此外，叶片中的原花青素B1，B2和B3在缺磷条件下均显著上调，而根系中只有原花青素B3受低磷条件诱导含量上升(图6)。

图6 低磷胁迫对假地豆原花青素、槲皮素及其衍生物积累的影响Fig.6 Effect of P deficiency on the accumulation of proanthocyanidins,quercetin and their derivatives in D.heterocarpon

2.5 低磷胁迫对假地豆有机酸、核苷酸及其衍生物的影响

如图7所示，在缺磷处理下，假地豆叶片中马来酰胺酸、芥子酸和5-氨基乙酰丙酸的积累显著增加，而羟基酒石酸、单咖啡酰酒石酸和肉桂酸的积累显著减少；假地豆根系中8种有机酸的含量受缺磷处理诱导显著上调，包括马来酰胺酸、异绿原酸C、苔色酸、京尼平苷酸、柠檬酸、奎宁酸、单咖啡酰酒石酸和肉桂酸。对于核苷酸及其衍生物，缺磷处理导致叶片和根系中2′-脱氧腺苷5′-单磷酸(dAMP)的积累均显著降低，此外，叶片的肌苷、腺苷、胸苷和尿苷的积累也显著减少(图7)。

图7 低磷胁迫对假地豆有机酸、核苷酸及其衍生物积累的影响Fig.7 Effect of P deficiency on the accumulation of organic acids,nucleotides and their derivatives in D.heterocarpon注：蓝色表示差异代谢物显著下调Note:Blue indicates significantly down-regulated differential metabolites

3 讨论

磷元素参与植物体内各种代谢过程，在很大程度上影响着植物生长发育[22]。前人关于小麦(Triticumaestivum)、紫花苜蓿和硬皮豆(Macrotylomauniflorum)的研究均显示，低磷胁迫下植株的生长受到抑制，地上部的生物量和磷含量均显著降低[23-25]。本试验与以上研究结果相似，随着处理时间的延长，缺磷处理抑制了假地豆地上部的生长，从而显著降低假地豆的地上部干重和磷含量(图1)。有研究表明，玉米和菜豆(Phaseolusvulgaris)的磷吸收量与根表面积、根总长度呈显著正相关[26-27]。本试验发现，在低磷胁迫下假地豆根部的总根长、根系表面积、根总体积均显著增加(图2)。这可能是由于植物通过改变根系形态提高了对土壤磷素的吸收能力，从而适应缺磷环境[28]。低磷胁迫下，植物通过大量分配碳水化合物(如糖类和醇类)到根系中，促进根系生长，提高根冠比，从而增加根系与土壤的接触面积，促进磷的吸收[29]。本试验代谢组分析表明，缺磷胁迫导致假地豆根系的4种糖及醇类的积累显著增加，这可能是缺磷胁迫下，假地豆通过分配更多的碳水化合物到根系中，促进根系生长。此外，假地豆还可以作为果树间作的绿肥，在橡胶(Heveabrasiliensis)和龙眼(Dimocarpuslongan)林下种植假地豆，可以达到改良土壤的效果[30-31]。

在低磷胁迫下，植物根系会增加苹果酸脱氢酶的表达量，调控多个转运蛋白(如苹果酸转运蛋白和柠檬酸转运蛋白等)，促进有机酸合成与分泌，从而活化土壤难溶性磷，释放出Pi供根系吸收[32-33]。比如柱花草(苹果酸)[14]、紫花苜蓿(柠檬酸)[34]和菜豆(苹果酸、柠檬酸)[35]等在低磷胁迫下根系合成和分泌的有机酸积累均有不同程度的增加。本试验发现，缺磷胁迫导致假地豆根系8个有机酸的含量显著积累(图7)，这可能有助于假地豆对难溶性磷的活化利用。类黄酮和原花青素具有增加抗氧化的能力。已有研究报道，低磷胁迫导致玉米[24]、茶(Camelliasinensis)[36]、大豆[37]等植物体内的类黄酮和原花青素的积累显著增加。本研究发现，缺磷胁迫导致假地豆叶片和根系分别有5种和4种槲皮素及其衍生物增加积累；此外，叶片和根系中的原花青素的含量在低磷胁迫下也有所增加。这些物质的积累可能有利于假地豆抵抗由于缺磷胁迫诱发的氧化损伤，增加假地豆的抗氧化能力。

核苷酸及其衍生物是植物体内主要的含磷代谢物类型之一。已有大量的研究表明，植物在低磷胁迫下会增加对核苷酸及其衍生物的再活化利用[38]。如，低磷胁迫导致拟南芥(Arabidopsisthaliana)[39]、大豆[40]、白羽扇豆(Lupinusalbus)[41]等植物体内的核苷酸及其衍生物的含量显著降低。这有可能是因为在低磷胁迫下，负责磷脂水解的磷脂酶C、磷脂酶D和磷脂酸磷酸酶等关键酶的表达量上调，导致磷脂降解而释放Pi[42]。本研究中，假地豆叶片和根系的dAMP的含量在缺磷胁迫下显著降低，很可能是由于假地豆为了缓解磷元素缺乏而对体内的核苷酸及其衍生物进行降解以释放出Pi。

4 结论

本研究发现假地豆的生长受到缺磷胁迫的影响，包括生理和代谢的改变。在缺磷胁迫下，假地豆地上部干重和磷含量显著降低，但根部的总根长、根系表面积、根总体积均显著增加。同时，假地豆通过改变根系形态，增加有机酸、糖类、槲皮素和原花青素的积累，增加对dAMP的再活化利用，从而适应缺磷胁迫。研究结果为解析假地豆耐缺磷胁迫机制提供了一定的科学依据。