孟鲁司特钠对支气管哮喘大鼠肺组织的影响及对核转录因子-κB通路的作用机制

郭青，刘珍

(郑州大学附属儿童医院 呼吸科，河南 郑州 450000)

支气管哮喘属于我国儿童呼吸系统常见的慢性气道炎症疾病。炎症使气道可逆性狭窄并导致患儿出现呼吸困难，支气管哮喘的炎症反应由多种抗原特异性炎症细胞所介导，因此可造成喘息的反复发作[1-3]。孟鲁司特钠是有效且安全的白三烯受体拮抗剂，是一种广泛被用于治疗儿童支气管哮喘的药物，在控制气道炎症和免疫方面的作用显著[4]。孟鲁司特钠能降低支气管哮喘儿童血清免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平，并能在一定程度上减少支气管哮喘急性发作频次，长期规范应用有助于实现支气管哮喘的临床控制[5]。但孟鲁司特钠的作用机制是否与核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路有关，国内外文献均尚无定论。本研究以支气管哮喘大鼠为研究对象，探讨孟鲁司特钠对支气管哮喘大鼠肺组织的保护作用，并进一步探讨了孟鲁司特钠对NF-κB通路的调控作用，为其在儿童支气管哮喘发作中的应用提供实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料40只约4周龄雄性清洁级Sprauge-Dawley大鼠，属远交群，体质量(160.00±10.00)g，购自郑州大学实验动物中心。大鼠被随机分为对照组、哮喘模型组、孟鲁司特钠低剂量组、孟鲁司特钠高剂量组，每组10只。适应性喂养1周后，其中哮喘模型组、孟鲁司特钠高剂量组、孟鲁司特钠低剂量组大鼠均被诱导成哮喘模型。本研究经郑州大学伦理委员会审核并批准(批准号2018-KY-89)。

1.2 试剂名称与检测仪器孟鲁司特钠(杭州默沙东制药有限公司，国药准字J20130054)。卵白蛋白(ovalbumin，OVA)(美国Sigma公司)，10%氢氧化铝[Al(OH)3](上海化学试剂有限公司)，鱼跃403C型雾化器(江苏医疗设备有限公司)，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附剂测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)。

1.3 大鼠哮喘模型的建立[6]在第1日和第8日，于哮喘模型组和孟鲁司特钠低剂量组(5 mg·kg-1)、孟鲁司特钠高剂量组(10 mg·kg-1)大鼠腹腔注射OVA和 Al(OH)3混合液 1 mL[含OVA、Al(OH)3各100 mg]予以致敏处理。第15日，给予哮喘模型组和孟鲁司特钠低剂量组、高剂量组雾化吸入20 g·L-1的OVA进行过敏激发，每次30 min，每日1次，连续6 d。大鼠出现呼吸心率加快、摆头、打喷嚏、点头呼吸时有声响、持续抓鼻孔、咳嗽、烦躁不安等表现说明哮喘模型成功建立。从第15日开始，对孟鲁司特钠低剂量组、孟鲁司特高剂量组大鼠每次OVA雾化前30 min按不同剂量灌胃，连续14 d。对照组和哮喘模型组以生理盐水灌胃。观察并记录第20日各组大鼠24 h内的进食量与饮水量，第21日应用自主活动仪测定5 min的活动次数与10 min的抓鼻次数[7]。

1.4 标本采集及肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α的检测均在末次雾化后24 h内将各组大鼠麻醉并处死，备皮并固定于动物手术台，暴露气管，沿环状软骨下缘做T形切口行气管插管，经插管注入5 mL生理盐水后回抽肺泡灌洗液，重复3次，回收率>80%为合格，收集于离心管中备用。游离右肺后自肺口近端离断，置于400 g·L-1多聚甲醛溶液中固定备用。按照酶联免疫吸附试剂盒说明书检测肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，测出各个样本指标相应的光密度(optical density，OD)值，根据相应水平的OD值计算相应浓度。

1.5 采用蛋白免疫印迹法检测各组大鼠肺组织p-p65、NF-κB的抑制蛋白α(inhibitor α of NF-κB，IκBα)表达水平准确称取以上各组大鼠肺组织250 mg，置入tube管内并加入0.5 mL裂解液进行匀浆，4 ℃下12 000×g离心2 min，舍弃沉淀物取上清液。以质量分数为12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转至硝酸纤维膜，随后加入一抗、二抗化学发光试剂显影，以β-actin蛋白作为内参。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白和内参蛋白的比值作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 大鼠的一般情况各组大鼠进食量、饮水量、活动次数、抓鼻次数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，哮喘模型组和孟鲁司特钠低剂量组每日进食量、饮水量减少，活动次数、抓鼻次数增加(P<0.05)。孟鲁司特钠低剂量组每日进食量、每日饮水量、活动次数、抓鼻次数与哮喘模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组每日进食量、每日饮水量、活动次数、抓鼻次数比较

2.2 大鼠肺泡灌洗液中炎症因子的表达水平各组肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，哮喘模型组和孟鲁司特钠低剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α水平较高(P<0.05)。与哮喘模型组比较，孟鲁司特钠低剂量组和孟鲁司特高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α水平较低(P<0.05)。孟鲁司特钠低剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α水平与孟鲁司特钠高剂量组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比较

2.3 大鼠肺组织p-p65、IκBα表达水平各组肺组织p-p65、IκBα表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，哮喘模型组p-p65表达上调，IκBα表达下调(P<0.05)。与哮喘模型组相比，孟鲁司特钠低剂量组和孟鲁司特高剂量组p-p65表达水平较低，IκBα表达水平较高(P<0.05)。孟鲁司特钠低剂量组与孟鲁司特钠高剂量组p-p65、IκBα表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组肺组织p-p65、IκBα表达水平比较

3 讨论

支气管哮喘为一种儿童肺部常见的慢性气道异质性疾病，特点是气道阻塞和气道高反应性。在临床上，支气管哮喘患儿往往表现为反复发作的咳嗽、喘息、胸闷和气短[8]。本研究结果显示，哮喘模型组大鼠每日进食量和饮水量均减少，活动次数及抓鼻次数均增加。这进一步证明了支气管哮喘可能导致大鼠出现鼻痒、烦躁不安、饮食及睡眠质量下降等症状。这与支气管哮喘本身的过敏反应有关，表明支气管哮喘对大鼠造成了严重的不良影响。孟鲁司特钠作为抗过敏平喘药长期应用于儿童哮喘的临床预防及基础治疗中，通过竞争性抑制白三烯受体的活性，进而显著减少支气管哮喘患儿呼吸道炎症细胞聚集和黏液分泌，缓解患儿呼吸道平滑肌痉挛，辅助改善哮喘发作的症状，长期规律给药有助于实现轻中度支气管哮喘的临床控制[9-10]。进一步对比研究结果发现，与哮喘模型组比较，加入孟鲁司特钠治疗后大鼠的进食量、饮水量、活动次数及抓鼻次数变化不显著。这可能是由于实验中未对大鼠进行其他抗喘息治疗手段的干预，也说明针对哮喘需要抗炎、平喘、抑制气道高反应、解除气管痉挛等全方位的治疗措施。孟鲁司特钠的具体作用机制仍有待进一步探讨。

支气管哮喘发病的分子机制与多个发病因素共同作用相关。支气管哮喘发作时，患者体内可能释放出大量的高浓度的炎症介质，导致支气管哮喘患儿气道出现持续高反应性，多种支气管炎症细胞可以参与哮喘的发病过程[11]。免疫细胞异常导致IL异常表达，尤其是IL-1β、IL-6，在支气管哮喘病理过程中起到关键作用[12]。IL-1β是IL-1的主要活化表达形式，是一种高特异性的敏感炎症指标[13]。Bakr等[14]研究已证实，IL-1β可以作为引起哮喘急性症状发作的一个重要炎症因子，主要参与免疫趋化因子和免疫黏附分子的异常表达、淋巴细胞增殖活化、嗜酸性粒细胞浸润、肥大细胞脱颗粒等过程。IL-6作为支气管哮喘的另一个重要炎症因子，是由淋巴细胞、单核巨噬细胞激活后合成的，参与机体炎症损伤过程。徐莉等[15]研究还发现，哮喘患者急性发作时血浆中IL-6的表达水平高于正常，缓解期血浆中IL-6表达水平几乎与正常人的无差异。哮喘急性发作治疗时，患者IL-6表达水平也与IgE水平呈正相关。TNF-α属于人体血浆中一种Th1型细胞因子，可直接损伤血管内皮细胞，促进白细胞的吸附，诱导炎症反应，参与免疫调节作用[16-17]。本研究结果显示，IL-1β、IL-6、TNF-α水平在哮喘模型大鼠中呈明显高表达，说明了IL-1β、IL-6、TNF-α细胞因子可共同作用，吞噬体内免疫系统，促进哮喘的发展进程。NF-κB是一种广泛表达和存在于生物各类复杂的真核细胞基因簇内的具有多向性的转录调节因子，参与转录调节过程，控制多种复杂的细胞因子、生化因子和酶等功能基因表达[18]。支气管哮喘的肺部炎症机理与复杂的网络转导联系紧密，其中NF-κB是重要的转导机制之一[19]。NF-κB是p65和p50组成的异源二聚体与IκBα结合存在于所有细胞的细胞质中并处于失活状态。当细胞受到外界某种特殊化学物质的刺激时，IκBα磷酸化而迅速降解，活化反应后的分解产物以p50-p65易位状态转移到细胞核，与相应的应答基因启动子结合，诱导基因转录，调节下游细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6等异常表达，可参与过敏性哮喘发作的炎症环节。白三烯释放过量是哮喘的主要原因之一[20]。孟鲁司特钠能够较好地抑制白三烯合成，有效缓解炎症反应，也能够有效抑制呼吸道炎症细胞的浸润，缓解气道的高反应性，达到有效治疗哮喘的目的。本研究发现，哮喘模型组p-p65表达上调，IκBα表达下调。这表明哮喘大鼠模型中NF-κB通路被异常激活。加入孟鲁司特钠治疗后，p-p65表达下调，IκBα表达较哮喘模型组升高，说明NF-κB通路的激活减弱。本研究发现孟鲁司特钠可以升高IκBα的表达水平，抑制NF-κB信号通路激活，进一步降低下游的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α释放，从而起到对支气管哮喘大鼠的治疗作用。

综上所述，孟鲁司特钠能够抑制NF-κB信号通路激活，抑制支气管哮喘大鼠气道炎症，减轻呼吸道炎症细胞聚集和黏液分泌，降低呼吸道高反应性，为今后支气管哮喘治疗及新药的研发提供新的参考指标和作用靶点。