丹参麦味颗粒质量标准研究

王 婷，江欢欢，刘恩荔，房嘉程，张思蔚，扈明玉，乔丽俊，郑晓俊

心悸怔忡是指病人自觉心中悸动、惊悸不安，甚则难以自持，患病率逐年增加，反复发作，严重者危及生命。丹参麦味颗粒由丹参、麦冬、酒女贞子、制何首乌等20余种药味组成，是医院应用传统工艺配制的中药制剂，经多年临床应用，治疗心悸怔忡疗效显著，具有良好的开发与应用前景，尚未建立科学有效的质量标准[1-2]。本研究采用薄层色谱法(TLC)对方中丹参、赤芍、佛手、芦根、当归、川芎、酒女贞子、制何首乌进行定性鉴别，采用高效液相色谱法(HPLC)对君药丹参中含量高且活性显著的指标成分丹酚酸B进行含量测定[3-5]，以期建立科学、规范的质量控制标准。

1 材料与方法

1.1 实验仪器 F-020S超声清洗机(深圳福洋科技集团有限公司)；JA5003电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；HH-2数显水浴锅(常州国华)；ZF-20D型暗箱三用紫外分析仪(骥辉)；KDM型可调控温电热套(山东华鲁)；Waters 2695高效液相色谱仪(美国沃特世科技有限公司)；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；硅胶G薄层板(烟台江友硅胶开发有限公司)。

1.2 实验药物 丹参麦味颗粒由晋中市中医院药剂科制备；丹酚酸B对照品(批号：121521-90-2，含量测定用)、佛手对照药材(AF20100116)、川芎对照药材(AF20112904)、当归对照药材(AF20100109)、麦冬对照药材(AF20100112)、芍药苷(AF20070752)、芦根对照药材(AF20100115)、大黄素(AF20021321)，购自成都埃法生物科技有限公司；丹参对照药材(120923-200610)、制何首乌对照药材(121454-201405)、酒女贞子对照药材(121041-201404)，均购自中国食品药品检定研究院。水为怡宝牌饮用纯净水；甲醇、乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司)均为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 薄层鉴别

1.3.1.1 丹参 取本品适量，研成细粉，称取10 g，置于锥形瓶中，加入25 mL水溶解，再置入分液漏斗中加入乙酸乙酯，萃取2次，每次15 mL，合并有机相，旋蒸，蒸干后加甲醇1 mL溶解残渣，得到供试品溶液。取丹参对照药材1 g，按上述方法制成对照药材溶液。按丹参麦味颗粒处方药材比例及制备工艺，制备除去丹参阴性样品，按上述供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。供试品溶液和阴性对照溶液各取15 μL、对照药材溶液取10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(4∶6∶8∶1∶6)为展开剂，展至距薄层板上沿1 cm处，取出，至室温下阴干，喷以2% FeCl3·CH3CH2OH溶液，置入干燥箱中，设置温度为105 ℃，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，与药材对照色谱对应位置显示相同颜色的斑点。详见图1A。

1.3.1.2 赤芍 称取本品粉末10 g，置具塞锥形瓶中，加入乙醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣加乙醇1 mL溶解，得到供试品溶液。取芍药苷对照品，按上述方法配制成浓度为1 mg/mL的对照品溶液。按丹参麦味颗粒处方药材比例及制备工艺，制备除去赤芍的阴性样品，按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。供试品溶液和阴性对照溶液各取15 μL、对照品溶液取5 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶1∶2∶0.3)为展开剂，展至距薄层板上沿1 cm处，取出，至室温下阴干，均匀喷以5%香草醛硫酸溶液，置入干燥箱中，设置温度为105 ℃，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，与对照品色谱对应位置显示相同颜色的斑点。详见图1B。

1.3.1.3 佛手 称取本品粉末10 g，置具塞锥形瓶中，加水25 mL使粉末溶解，再加入正丁醇30 mL，超声处理30 min，移至分液漏斗中，静置分层，弃去水液，将正丁醇液旋蒸，蒸干后加甲醇2 mL溶解残渣，得到供试品溶液。取佛手对照药材0.5 g，按上述方法制得对照药材溶液。按丹参麦味颗粒处方药材比例及制备工艺，制备除去佛手的阴性样品，同上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。供试品溶液和阴性对照溶液各取15 μL、对照药材溶液取10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(6∶2)为展开剂，展至距薄层板上沿1 cm处，取出，置室温下阴干，紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱对应位置显示相同颜色的蓝色荧光。详见图1C。

1.3.1.4 芦根 称取本品粉末10 g，置入具塞锥形瓶中，加水25 mL使粉末溶解，再加二氯甲烷30 mL，超声处理30 min，转移至分液漏斗中，静置分层，弃水液，将二氯甲烷液旋蒸，蒸干后加二氯甲烷2 mL溶解残渣，得到供试品溶液。取芦根对照药材0.5 g，按上述方法制得对照药材溶液。按丹参麦味颗粒处方药材比例及制备工艺，制备除去芦根的阴性样品，同上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。供试品溶液和阴性对照溶液各取15 μL、对照药材溶液取10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚-甲酸乙酯-甲酸(14∶4∶1)为展开剂，展开至薄层板上沿1 cm处，取出，置室温下阴干，均匀喷以显色剂磷钼酸溶液，置干燥箱中，设置温度为105 ℃，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，与对照药材色谱对应位置显示相同颜色的斑点。详见图1D。

1.3.1.5 麦冬 称取本品粉末10 g，置入具塞锥形瓶中，加水25 mL使粉末溶解，再加盐酸2 mL，置100 mL圆底烧瓶中，水浴加热回流30 min，放冷后过滤，转移至分液漏斗中，加入二氯甲烷，萃取两次，每次25 mL，合并有机相，旋蒸，蒸干后加甲醇1 mL溶解残渣，得到供试品溶液。取麦冬对照药材1 g，按上述方法制得对照药材溶液。按丹参麦味颗粒处方药材比例及制备工艺，制备除去麦冬的阴性样品，同上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。供试品溶液、对照药材溶液和阴性对照溶液各取5 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮(4∶1)为展开剂，展开至距薄层板上沿1 cm处，取出，置室温下阴干，紫外灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱对应位置显示相同颜色的斑点。详见图1E。

1.3.1.6 当归和川芎 称取本品粉末10 g，置入具塞锥形瓶中，加乙酸乙酯25 mL，超声处理20 min，滤过，重复提取1次，合并提取液，旋蒸，蒸干后加乙醇1 mL溶解残渣，得到供试品溶液。分别称取当归、川芎对照药材各1 g，按上述方法制得对照药材溶液。按丹参麦味颗粒处方药材比例及制备工艺，制备除去当归和川芎的阴性样品，按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。供试品溶液和阴性对照溶液各取15 μL、当归和川芎对照药材各取10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以石油醚-丙酮(9∶4)为展开剂，展开至距薄层板上沿1 cm处，取出，置室温下阴干，紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱对应位置显示相同颜色的斑点。详见图1F。

1.3.1.7 酒女贞子 称取本品粉末10 g，置入具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，旋蒸，蒸干后加甲醇1 mL溶解残渣，得到供试品溶液。取酒女贞子对照药材1 g，按上述方法制得对照药材溶液。按丹参麦味颗粒处方药材比例及制备工艺，制备除去酒女贞子的阴性样品，按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。供试品溶液和阴性对照溶液各取15 μL、对照药材溶液取10 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸(8∶0.2∶0.2)为展开剂，展开至距薄层板上沿1 cm处，取出，置室温下阴干，紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，与对照药材色谱对应位置显示相同颜色的斑点。详见图1G。

1.3.1.8 制何首乌 称取本品粉末10 g，置入具塞锥形瓶中，加乙醇30 mL，超声处理30 min，旋蒸，蒸干后加1 mL乙醇溶解残渣，得供试品溶液。取何首乌对照药材1 g，同法制得对照药材溶液。取大黄素对照品适量，同法制成浓度为5 mg/mL的对照品溶液。按丹参麦味颗粒处方药材比例及制备工艺，制备除去制何首乌的阴性样品，按上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。供试品溶液和阴性对照溶液各取35 μL、对照品和药材对照溶液各取5 μL，点于同一块硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-36%乙酸(4∶1∶1∶0.8)为展开剂，展开至距薄层板上沿1 cm处，取出，置室温下阴干，紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，与对照品和药材对照色谱对应位置显示相同颜色的斑点。详见图1H。

1.3.1.9 佛手、当归和川芎的“整体鉴别” 按照1.3.1.6步骤中当归和川芎的TLC鉴别方法分别吸取步骤中供试品溶液15 μL，步骤中佛手对照药材10 μL，1.3.1.6步骤中当归和川芎对照药材各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，展开剂及检视条件同1.3.1.6项。供试品色谱中，与佛手、当归和川芎对照药材对应位置显示相同颜色的荧光斑点。详见图1I。

图1 薄层色谱图(A为丹参：1～3为供试品，4为对照药材，5为阴性对照；B为赤芍：1～3为供试品，4为芍药苷对照品，5为阴性对照；C为佛手：1～3为供试品，4为对照药材，5为阴性对照；D为芦根：1～3为供试品，4为对照药材，5为阴性对照；E为麦冬：1～3为供试品，4为对照药材，5为阴性对照；F为当归和川芎：1～3为供试品，4为当归对照药材，5为川芎对照药材，6为阴性对照；G为酒女贞子：1～3为供试品，4为对照药材，5为阴性对照；H为制何首乌：1，3为供试品，2为大黄素对照品，4为对照药材，5为阴性对照；I为佛手、当归和川芎：1为佛手对照药材，2～3为供试品，4为当归对照药材，5为川芎对照药材)

1.3.2 丹酚酸B含量测定

1.3.2.1 色谱条件 色谱柱Shim-pack VP-ODS柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.1%磷酸水(22∶78)；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长286 nm。

1.3.2.2 对照品溶液的制备 取丹酚酸B对照品适量，精密称定，置入50 mL容量瓶中，加入80%甲醇水溶液使溶解，摇匀并定容，制成浓度为216.0 μg/mL的对照品储备液。精密吸取对照品储备液10 mL，加入100 mL容量瓶中，加80%甲醇水溶液，定容并摇匀，即得对照品溶液(浓度21.6 μg/mL)。

1.3.2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末4.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇水溶液20 mL，称定重量，超声处理(120 W，40 kHz) 40 min，冷却至室温，称定，采用80%甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀、滤过，取续滤液，即得。

1.3.2.4 阴性对照溶液的制备 取组方中除丹参外的其他全部药味，根据丹参麦味颗粒剂的组方比例及制备工艺，制备缺少丹参的阴性对照样品，按1.3.2.3步骤中供试品溶液的制备方法制备，即得。

1.3.2.5 专属性实验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定。结果显示，丹酚酸B对照品溶液、阴性溶液、供试品溶液在丹酚酸B保留时间处，均无其他成分干扰，且色谱峰分离度>1.5。详见图2。

图2 高效液相色谱图(A为丹酚酸B对照品溶液；B为丹参麦味颗粒供试品溶液；C为阴性对照溶液)

1.3.2.6 线性关系分析 分别精密吸取对照品储备液1.0 mL、3.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL、7.0 mL，置于25 mL、50 mL、100 mL、100 mL、100 mL、50 mL量瓶中，精密加80%甲醇水溶液，分别制成浓度为8.64 μg/mL、12.96 μg/mL、17.28 μg/mL、21.60 μg/mL、25.92 μg/mL、30.24 μg/mL的对照品溶液，按照1.3.2.1的色谱条件进行测定，记录峰面积。以对照品进样量(x)作为横坐标，峰面积(y)作为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程：y=106x-19 835，r2=0.999 3。结果显示，丹酚酸B在浓度范围0.172 8～0.604 8 μg内线性关系良好。详见图3、表1。

图3 线性回归图

表1 线性关系

1.3.2.7 重复性实验 取丹参麦味颗粒(20210303)样品6份，每份约4.0 g，精密称定，按照1.3.2.3方法制备供试品溶液，按照1.3.2.1步骤中色谱条件进行测定，记录峰面积。结果显示，相对标准偏差(RSD)值为0.90%(n=6)，表明方法重复性良好。详见表2。

表2 重复性实验结果(n=6)

1.3.2.8 精密度实验 取1.3.2.3步骤中的供试品溶液，连续进样6次，每次20 μL，记录峰面积。结果显示，丹酚酸B峰面积的RSD值为1.13%(n=6)，提示仪器精密度良好。详见表3。

表3 精密度实验结果(n=6)

1.3.2.9 稳定性实验 取1.3.2.3步骤中供试品溶液进行稳定性实验，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h时进样，记录谱图。结果显示，供试品溶液中丹酚酸B峰面积的RSD值为1.46%(<5.0%)，表明供试品溶液在配制完成后24 h内比较稳定。详见表4。

表4 对照品溶液稳定性

1.3.2.10 加样回收率实验 取约2.0 g本品粉末9份，精密称定，置入具塞锥形瓶中，分为3组，每组3份，分别精密加入1.3.2.6步骤浓度为17.96 μg/mL、21.60 μg/mL、25.92 μg/mL的对照品溶液20.0 mL，分别称重，密塞，采用超声处理(120 W，40 kHz)40 min，冷却至室温，重新称定，加入80%甲醇水溶液补足减失重量，滤过，取续滤液即得低浓度、中浓度、高浓度样品溶液。分别精密吸取20 μL上述样品溶液，注入液相色谱仪，测定并计算回收率。

1.3.2.11 样品测定 取丹参麦味颗粒(20210303，20210304，20210305)样品，按照1.3.2.3步骤制备供试品溶液，按1.3.2.1步骤色谱条件进行测定。

2 结 果

2.1 加样回收率实验结果 结果显示：低浓度、中浓度、高浓度回收率为95.20%～98.61%，RSD值为1.50%。详见表5。

表5 加样回收率实验结果(n=9)

2.2 丹酚酸B在样品中的含量测定结果(见表6)

表6 丹酚酸B在样品中的含量测定结果(n=3)

3 讨 论

3.1 TLC鉴别药味的选择 该制剂方中丹参具有抗心律失常、抗动脉粥样硬化、保护血管内皮细胞等作用；麦冬具有抗心肌损伤、心律失常、血栓及改善微循环等作用[6-8]，二者作为君药，首选列入薄层鉴别项；酒女贞子具有强心、抗动脉粥样硬化等作用[9]；佛手具有降血压的作用[10-11]；当归具有改善心肌组织病理损伤及增强心血管功能等作用[12-13]；川芎在心血管疾病中有显著的临床疗效[14]；赤芍治疗动脉粥样硬化和心肌损伤[15]；制何首乌具有降血脂等作用[16]；芦根具有保肝、抗氧化、改善脂代谢等作用[17-18]。因此，选用这9味药进行TLC定性鉴别。

3.2 中药复方TLC整体鉴别方法初探 本研究按照传统的TLC鉴别方法，分别根据各药味所含指标成分的特性，选择特定的提取溶剂，采用单独的层析条件和显色方法，在同一块薄层板上仅鉴别1味药味。这种方法能充分满足复方制剂定性鉴别，但存在鉴别次数多，耗时长，效率低等不足。本研究在传统鉴别方法基础上，借鉴整体鉴别思路[19]，分析佛手、当归和川芎3种药在同一薄层色谱条件下的分离效果，建立了同时鉴别3种药的TLC鉴别方法。

3.3 含量测定指标成分及色谱条件的确定 选用合适的指标性成分是含量测定的关键因素之一[20]。丹参的有效成分主要为二萜醌类成分(脂溶性)和酚酸类成分(水溶性)，其中丹参酮ⅡA与丹酚酸B在丹参中含量较高且药理活性突出[21-22]。《中国药典》中丹参药材含量测定以丹参酮ⅡA与丹酚酸B为指标。因该制剂采用传统水煎煮工艺制备而成，丹参酮ⅡA水溶性差，转移率低，故本研究选择水溶性成分丹酚酸B作为含量测定指标成分。丹参水溶性成分含量测定多以乙腈或者甲醇作为有机相，以乙酸溶液或磷酸溶液作为非有机相，柱温集中在20～40 ℃，波长范围200～290 nm，为探求最佳色谱条件乙腈-0.1%磷酸溶液(22∶78)，分离度符合要求[23-30]。

综上所述，通过制定丹参麦味颗粒TLC鉴别方法和HPLC含量测定方法，建立了丹参麦味颗粒的质量控制标准，该方法简便、可靠、专属性强、稳定性好，可用于制剂的质量控制。