未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p、KLF5表达水平及临床意义

薛诚 马骏

颅内动脉瘤是一种对人类健康危害严重的脑血管疾病[1]。随着老龄化的加剧及血管成像检查的普及，未破裂颅内动脉瘤在越来越多的老年病人中被检出[2]。炎性反应介导的血管破坏及重构是导致动脉瘤形成、进展及破裂的重要机制[3-4]。Krüpple样因子5(krüppel-like factor 5，KLF5)在血管生成、细胞增殖、迁移及炎症等血管重构过程中发挥重要作用[5-6]。miR-448-3p可通过下调KLF5介导的炎症反应，进而抑制大鼠颅内动脉瘤的进展[7]。本研究检测未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p、KLF5表达水平，分析两者与病人临床特征及体内炎症水平的关系。

对象与方法

一、对象

2017年9月～2020年5月本院收治的未破裂颅内动脉瘤病人143例为观察组。纳入标准：(1)初次确诊，经核磁共振血管成像或脑血管造影诊断为未破裂颅内动脉瘤；(2)病人知情并签署知情同意书；(3)获得本院伦理委员会批准。排除标准：合并其他肿瘤、传染性疾病、感染性疾病及其他严重脏器疾病；有严重头部外伤史、脑血管卒中病史者；临床资料不完整。同期体检健康者150例为对照组，均经核磁共振血管成像或脑血管造影确定无颅内动脉瘤。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 两组一般资料比较

二、方法

1.材料：SYBR Green qRT-PCR试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；人IL-6、TNF-α酶联免疫(ELISA)试剂盒购自上海哈灵生物科技有限公司；ABI 7500型荧光定量PCR仪购于美国Applied Biosystems公司；ELX800型全自动酶标仪购于美国BIO-TEK公司。

2.血液采集及指标检测：未破裂颅内动脉瘤病人入院时、体检者体检时抽取静脉血5 ml，4 ℃ 4 000 r/min离心10分钟，留取上层血清，分装、置于-80 ℃冰箱保存。血清miR-448-3p、KLF5 mRNA表达水平检测：将血清样品置于冰上融化，用TRIzol法提取总RNA。以RNA样本为模板，反转录合成cDNA，反应条件：37 ℃ 16分钟，84 ℃ 6秒。取cDNA样本为模板，在荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR反应，miR-448-3p、KLF5 mRNA表达结果以2-ΔΔCt相对定量法表示，反应条件：96 ℃ 2分钟，96 ℃变性15秒，62 ℃退火30秒，70 ℃延伸10秒，共36个循环。miR-448-3p正向引物：5′-TTATTGCGATGTGTTCCTTATG-3′，逆向引物：5′-ATGCATGCCACGGGCATATACACT-3′；KLF5正向引物:5′-GCTCGCTAGCCTCGAAAGCTAAACGCAATGTCATTTTT-3′，逆向引物：5′-ATGCCTGCAGGTCGACTGTGTCTCACTGTGTATTACATGC-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，逆向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin正向引物：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，逆向引物：5′-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT-3′。血清炎症水平检测：将血清样品置于冰上融化，使用IL-6、TNF-α ELISA试剂盒分别进行检测，具体操作按试剂盒说明书进行，在加终止液后的10分钟之内，使用酶标仪(450 nm)测定吸光度(optical density，OD)值，根据IL-6、TNF-α标准液的OD值分别绘制标准曲线，根据血清样品的OD值计算血清IL-6、TNF-α水平。

三、统计学分析

表2 血清miR-448-3p、KLF5 mRNA水平与临床特征的关系

结果

1.两组血清miR-448-3p、KLF5 mRNA表达水平比较：观察组和对照组血清miR-448-3p分别为(0.78±0.15)vs (1.26±0.17)，KLF5 mRNA方便为(2.17±0.24)和(1.35±0.18)，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p、KLF5 mRNA表达水平与临床特征的关系见表2。结果表明，不同年龄、性别、瘤位置的未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p、KLF5 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)；与瘤数目=1个相比，瘤数目≥2个的未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p水平显著降低，KLF5 mRNA水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与瘤直径<7 mm相比，瘤直径≥7 mm的未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p水平显著降低，KLF5 mRNA水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

3.对照组与观察组血清炎症水平比较：观察组与对照组血清IL-6分别为(118.54±8.14)mmol/L 和(34.65±6.23)mmol/L，TNF-α分别为(610.12±34.15)mmol/L 和(136.32±16.38)mmol/L，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

4.未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p、KLF5 mRNA表达水平与炎症水平的相关性：相关性分析显示，未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p与IL-6、TNF-α水平均呈负相关(r=-0.442、-0.471，P<0.05)，血清KLF5 mRNA与IL-6、TNF-α水平均呈正相关(r=0.454、0.523，P<0.05)。

5.未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p水平与KLF5 mRNA水平的相关性：相关性分析结果显示，未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p水平与血清KLF5 mRNA水平呈负相关(r=-0.429，P<0.05)。

6.血清miR-448-3p、KLF5 mRNA水平对未破裂颅内动脉瘤的诊断分析：ROC分析结果显示，血清miR-448-3p表达水平的ROC曲线下面积为0.978(95%CI：0.965～0.990)，截断值为1.00，敏感度为93.7%，特异性为90.7%，约登指数为0.944；血清KLF5 mRNA表达水平的ROC曲线下面积为0.995(95%CI：0.991～1.000)，截断值为1.77，敏感度为95.8%，特异性为98.7%，约登指数为0.945。见图1。

图1 ROC分析血清miR-448-3p、KLF5 mRNA水平对未破裂颅内动脉瘤的诊断价值

讨论

颅内动脉瘤是指颅内动脉在先天性肌层缺陷、后天获得性内弹力层变性、血流动力学负荷等因素作用下，颅内动脉管腔逐渐异常扩张、膨出，是一种常见的脑血管疾病，常发于颅底动脉分叉处[8]。颅内动脉血管平滑肌细胞形成的细胞外基质与内弹性层在产生、降解之间的不平衡，会导致脑血管炎症，进而诱导颅内动脉瘤的形成、生长及破裂，因此认为脑血管炎症是诱发颅内动脉瘤形成、生长、破裂的重要因素[9]。本研究亦显示，观察组未破裂颅内动脉瘤病人血清IL-6、TNF-α水平较对照组显著升高，表明炎症反应参与未破裂颅内动脉瘤发生，与上述研究结果基本一致，进一步说明炎症反应是导致未破裂颅内动脉瘤发生的主要因素。

未破裂颅内动脉瘤发生破裂会引起颅内出血，导致严重并发症，具有较高的潜在致死、致残风险。尽管仅有少部分病人会出现破裂，但探索影响未破裂颅内动脉瘤形成、生长及破裂的因素以便及时予以积极预防或治疗，仍具有重要意义。miRNA是在生物体中调控发育、分化、衰老等生物学过程的重要分子，能调控血管炎症，可能在动脉瘤形成及发展中起重要作用[10-11]。秦浩等[12]研究发现，未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-126表达升高，miR-125b表达降低，检测miR-126、miR-125b表达水平有助于判断未破裂颅内动脉瘤的数目和直径。张建忠等[7]研究表明，miR-448-3p可以抑制颅内动脉瘤的进展。本研究显示，观察组未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p水平较对照组显著降低，其水平与病人的年龄、性别、瘤位置无显著关系，但在不同瘤数目、瘤直径病人中差异显著，即血清miR-448-3p水平与瘤数目、瘤直径关系密切，表明miR-448-3p参与未破裂颅内动脉瘤发生及生长。本研究显示，未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p水平与血清IL-6、TNF-α水平呈负相关，表明miR-448-3p在未破裂颅内动脉瘤中的表达与炎症反应关系密切。

KLF5是含有锌指结构的、能调控DNA转录的转录因子，在炎症因子刺激下，能激活炎症反应信号通路，进一步加重炎症反应，能在血管重塑过程中发挥重要作用。庄红等[13]研究表明，沉默KLF5能通过抑制NF-κB通路，减少氧化应激条件下的心肌细胞炎症因子分泌。张曼莉等[14]研究表明，KLF5能与NF-κB p50相互作用，对高糖诱导血管平滑肌细胞炎症反应起促进作用。周静等[6]研究表明，桑黄素能改善糖尿病血管的炎性病变，其机制与抑制KLF5表达有关。本研究显示，观察组未破裂颅内动脉瘤病人血清KLF5 mRNA水平较对照组显著升高，其水平在不同瘤数目、瘤直径病人中差异显著，表明KLF5参与未破裂颅内动脉瘤的形成、生长。进一步相关性分析结果表明，未破裂颅内动脉瘤病人血清KLF5 mRNA水平与血清IL-6、TNF-α水平呈正相关，与血清miR-448-3p水平呈负相关，表明KLF5参与未破裂颅内动脉瘤病人体内的炎症反应，且与miR-448-3p表达关系密切。ROC曲线评估结果显示，血清miR-448-3p、KLF5 mRNA表达水平诊断未破裂颅内动脉瘤的ROC曲线下面积分别为0.978、0.995，敏感度分别为93.7%、95.8%，特异性分别为90.7%、98.7%，均具有一定诊断价值。

综上所述，未破裂颅内动脉瘤病人血清miR-448-3p水平升高，KLF5 mRNA水平降低，两者关系密切，可能共同调控体内炎症反应，影响未破裂颅内动脉瘤进展。