燕窝酶解液的制备及其抗流感病毒作用初探

路鑫怡 沃恩康 杨新燕 杨灿 徐琦 杨柳 何泳愉 项婷婷 郭潮潭

杭州医学院检验医学院与生物工程学院，杭州 310013

流感病毒是一种急性人畜共患传染病，抗流感病毒药物是控制流感的重要手段，但因病毒易发生变异，使得药物易产生耐药性。 有研究显示，从燕窝水提液中获得的一种病毒血凝反应抑制剂，具有广谱抗病毒效应，可见有效利用燕窝活性成分，可为抗流感病毒药物的研发打下基础。 对燕窝进行酶提取，可减少其中过敏性和难消化的化合物。 本研究尝试建立燕窝酶解液的制备方法，并研究其抗流感病毒作用，现报告如下。

材料与方法

一、细胞系与病毒株

犬肾上皮细胞系MDCK 细胞，小鼠单核巨噬细胞系Raw264.7 细胞，病毒株A/Memphis/1/71(H3N2)（简称Memphis）均为本实验室保存。 MDCK 细胞采用 5%新生牛血清(NBS)的 DMEM 培养；Raw264.7 细胞采用10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培养。 感染性实验均使用含有 1 μg/mL TPCK 胰酶的DMEM 作为稀释缓冲液。

二、试剂及设备

燕窝购自华东医药；中性蛋白酶和茚三酮试剂购自上海源叶生物科技有限公司；冰醋酸、硫酸铵购自上海麦克林生化科技有限公司；RNA 提取试剂盒、cDNA 合成试剂盒和SYBR Green 荧光定量试剂购自翊圣生物科技有限公司；DMEM/High 培养基购自 Cellmax；NP 抗体、M2e 抗体、M1a 抗体 (1∶1 000)由本实验室制备并保存；β-actin 抗体 (1∶1 000)、Phospho-IKKα/β 抗 体 、IKKα/β 抗 体 、Phospho-NF-κBp65 抗体和 NF-κBp65 抗体购自 Cell Signaling 科技公司；山羊抗小鼠、山羊抗兔HRP 抗体(1∶5 000)购自杭州华安生物科技有限公司；MTT、二甲基亚砜（DMSO）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物合成委托上海捷瑞生物技术有限公司，引物序列如表1 所示。

表1 实时荧光定量PCR 引物序列

注：NP：流感病毒核蛋白；M：流感病毒基质蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

基因 上游（5'-3'） 下游（5'-3'）NP CAACATACCAGAGGACAAG ATCAACTCCATCACCATTG M AAGTGAGCAGGCAGCAGAG CTCGCAGCAACAACAAGAGG IL-1β AGTGATGAGAATGACCTGTT GATACTGCCTGCCTGAAG IL-6 TCCATCCAGTTGCCTTCT TAAGCCTCCGACTTGTGA IFN-γ ATCTGGAGGAACTGGCAA GTGTGATTCAATGACGCTTA TNF-α GACCCTCACACTCAGATCATCTTCT GCTACGACGTGGGCTACAG NG-κBp65 GAAGCACAGATACCACCAA CAGCCTCATAGTAGCCATC GAPDH GAAGGTCGGTGTGAACGGATTTG CATGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA

三、方法

1.确定燕窝酶解条件

称取0.12 g 燕窝放入锥形瓶中，按照液料比分别为 20∶1、30∶1、40∶1、45∶1 和 50∶1 加入蒸馏水使燕窝充分溶胀。 随后各添加10 mL 中性蛋白酶，酶解1 h，而后沸水浴10 min 使酶灭活。取10 mL 酶解后的液体加入10 mL 的50%醋酸溶液。 在酸性环境下利用茚三酮试剂测定不同液料比对唾液酸提取率的影响。 在固定合适液料比的情况下，试验不同的酶解时长(0~8 h)对唾液酸提取率的影响。 每个液料比和每个酶解时长重复6 次。

唾液酸提取率计算公式为：x=[c×50×10/（V×0.006077）]×100%

式中，x 表示唾液酸提取率(%)；c 表示从标准曲线上查到的唾液酸浓度 （mg/mL）；V 表示样本体积（mL）；50 表示提取后定容体积（mL）；0.006077 表示1 g 标准燕窝中唾液酸的含量（g）。

2.燕窝酶解液对MDCK 细胞毒性作用

用不含血清的细胞培养液将燕窝酶解液、燕窝液和中性蛋白酶分别从2.4 mg/mL 和5.52 mg/mL按2 倍倍比稀释为8 个浓度。MDCK 细胞接种于96孔板中，每孔加入2 倍稀释的样本，每个稀释度重复6 次。 同时设立正常细胞对照组和空白凋零组，置于培养箱中培养24 h，用MTT 检测细胞存活情况并计算细胞存活率，选择细胞生存率高于50%的浓度作为样本最大使用浓度。 细胞存活率=[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

3.燕窝酶解液对流感病毒的体外抑制试验

因此，在英语教学中要注重拓宽学生的语言文化知识，培养深刻理解不同文化内涵的能力，培养学生树立远大理想，具有把握现实、面向未来、立足本国、面向世界的远见卓识，形成正确价值观和优秀品质，通过提升学生的人文精神，具备自觉抵制利己主义、拜金主义、价值迷失、信仰危机等不良思想文化渗透的能力，具备跨文化交际和传播中国优秀文化的能力和素养，培养学生的民族自信，在学好英语语言和文化的同时，培养学生的爱国情操、社会责任感和历史使命感，要有忧患意识，要懂得珍惜今天来之不易的幸福生活，切实懂得国家强大的意义。

采用以下3 种方式进行燕窝酶解液对流感病毒的体外抑制试验：①对流感病毒的直接抑制：燕窝酶解液和4 HAU 的病毒液混匀置于37 ℃孵育4 h，混合液加入MDCK 细胞感染1 h， 弃去混合液，用PBS 洗去多余病毒后加入无血清培养液继续培养24 h；②对流感病毒吸附阶段的抑制：燕窝酶解液加入细胞培养板中吸附4 h，弃去后用PBS 洗去多余燕窝并加入4 HAU 的病毒液接种1 h， 弃去后用PBS 洗去多余病毒， 加入无血清培养液继续培养24 h； ③对流感病毒吸附后复制增殖的抑制：MDCK 细胞中加入 4 HAU 的病毒液接种 1 h，弃去后用PBS 洗去多余病毒， 用不含血清的燕窝酶解液继续培养24 h。 试验根据所需的样本分为3 组：燕窝酶解液组、燕窝液组和中性蛋白酶组，同时设立病毒对照组。 24 h 后收集细胞上清进行血凝试验， 根据细胞上清在稀释数倍后是否引起红细胞凝集现象判断子代病毒产生量，每组重复2 次；收集细胞分别进行实时荧光定量PCR 对流感病毒的核蛋白NP 和基质蛋白M 的转录情况进行检测，每组重复3 次。

4.燕窝酶解液对流感病毒作用时间试验

MDCK 细胞接种于 6 孔板， 用 4 HAU 病毒液吸附MDCK 细胞， 作用1 h 后用 PBS 洗去未吸附的病毒，接着加入无血清培养基进行孵育。 将燕窝酶解液/燕窝液分别在吸附前4 h（-4 h）和吸附前2 h（-2 h），病毒开始孵育（0 h）、病毒孵育后 2 h（2 h）和孵育后4 h（4 h）加入细胞孔中。 24 h 后收集细胞采用实时荧光定量PCR 检测流感病毒NP 的转录水平，每组重复3 次。 根据所用的试验样本分为燕窝酶解液组和燕窝液组，另设病毒对照组加入等量PBS。

5. 燕窝酶解液对流感病毒激活的NF-κB 及炎症因子表达水平影响的检测

燕窝酶解液和燕窝液分别与4 HAU 病毒液混合均匀置于 37 ℃孵育 4 h。 4 h 后分别加入到Raw264.7 细胞中感染1 h， 弃去混合液后继续培养24 h。 24 h 后收集细胞进行实时荧光定量PCR 和Western 印迹法，每组重复3 次。

四、统计学分析

采用Grapad.Prism.v8.0 软件对数据进行作图绘制并进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、液料比和酶解时长

从图1 A 中可见， 燕窝中唾液酸的提取率随液料比的增大而上升，在 45∶1 时最高，达到（35.24±0.18）%， 此后在液料比为 50∶1 时， 提取率下降至（11.38±0.02）%。 从图 1 B 中可见，在液料比为 45∶1的条件下， 燕窝中唾液酸的提取率在3 h 时达到最大值，为（66.87±0.05）%，此后随着酶解的时间延长提取率未见明显升高。 为使燕窝中唾液酸的提取率达到理想条件，确定酶解的条件为：液料比45∶1 和酶解时长不低于3 h。

二、燕窝酶解液的细胞毒性

图2 所示，随着稀释倍数的增加和样本浓度的降低，燕窝酶解液组和中性蛋白酶组细胞生存率逐渐增高，燕窝组细胞生存率与浓度未见明显的依赖关系。 选择细胞生存率高于50%的浓度作为最大使用浓度，显示燕窝酶解液组和燕窝液组的最大使用浓度均为1.22 mg/mL，中性蛋白酶组为0.69 mg/mL。

图2 燕窝酶解液对MDCK 细胞毒性作用（n=6）

三、燕窝酶解液对流感病毒的体外抑制作用

1.对子代病毒的影响

如图3 所示， 使用流感病毒吸附后复制增殖的抑制方式，燕窝酶解液组子代病毒产生量为病毒对照组的1/4；而使用直接抑制方式，子代病毒产生量为病毒对照组的1/2。 燕窝酶解液组和燕窝液组对流感病毒吸附阶段的抑制作用不影响子代病毒的产生。

图3 燕窝酶解液不同体外抑制方式对子代流感病毒产生量的影响

2.不同抑制方式对流感病毒基因NP 和M 转录水平的影响

采用直接抑制方式，不同组别的流感病毒基因NP 和 M 差异均有统计学意义（F=9.92，P=0.005；F=11.27，P=0.003），详见表2。与病毒对照组相比，燕窝酶解液组NP 和M 的转录水平明显降低 （t=-2.81，P=0.023；t=-3.34，P=0.010）， 而中性蛋白酶组升高（t=2.16，P=0.040；t=2.38，P=0.045）。

采用吸附阶段进行抑制， 不同组别的流感病毒基因NP 和M 转录水平差异均有统计学意义（F=6.14，P=0.018；F=14.31，P<0.001），详见表 2。与病毒对照组相比， 燕窝酶解液组NP 和M 的转录水 平 升 高 近 2 倍 （t=2.56，P=0.034；t=3.41，P=0.009），而燕窝液组降低（t=-1.57，P=0.154；t=-3.11，P=0.014）。

采用吸附后复制增殖进行抑制，不同组别的流感病毒基因M 的转录水平差异具有统计学意义（F=6.24，P=0.017），详见表 2。 相比病毒对照组，燕窝液组 M 的转录水平降低（t=-3.05，P=0.016）。

表2 燕窝酶解液不同体外抑制方式对病毒基因NP 和M 转录水平的影响

注：NP：流感病毒核蛋白；M：流感病毒基质蛋白；三种抑制模式下各自病毒对照组的Ct 平均值取等于1；直接抑制模式下，NP：16.82±0.06；M：16.14±0.90；吸附阶段抑制模式下，NP：13.51±1.03；M：12.78±0.18；吸附后复制增殖阶段抑制模式下，NP：13.42±0.75；M：12.90±0.03；: 与病毒对照组相比，P<0.05；:与燕窝酶解液组相比，P<0.05

相对于病毒对照组病毒基因NP 和M 的相对转录水平直接抑制 吸附阶段抑制 吸附后复制增殖阶段抑制NP M NP M NP M燕窝酶解液组 3 0.41±0.14a 0.43±0.06a 1.09±0.16a 1.13±0.14a 1.69±0.27 1.67±0.24燕窝液组 3 0.73±0.20 0.74±0.13 0.91±0.18b 0.61±0.18ab 0.58±0.08 0.39±0.14ab中性蛋白酶组 3 1.52±0.34ab 1.41±0.31ab 1.40±0.20 1.00±0.12b 1.31±0.46a 0.93±0.29 F 值 9.92 11.27 6.14 14.31 3.79 6.24 P 值 0.005 0.003 0.018 <0.001 0.059 0.017组别 份数

四、燕窝酶解液在不同作用时间抑制流感病毒的效果

表3 显示， 不同组别在不同作用时间NP 转录水平比较差异有统计学意义（F=230.90、5.76、197.00、427.20 和 39.89，P 均＜0.05）。 与病毒对照组相比，在0 h 和2 h 时燕窝酶解液组NP 基因的转录水平降低 10 倍 （t=-13.79，P=0.005；t=-21.84，P=0.002）；燕窝液组 NP 转录水平也降低 （t=-13.22，P=0.006；t=-36.94，P=0.001）， 差异具有统计学意义； 在-4 h和-2 h 及4 h 加入燕窝酶解液处组，NP 基因转录水平升高（t=19.22，P=0.003；t=2.97，P=0.097；t=2.43，P=0.136）。

表3 燕窝酶解液不同作用时间对流感病毒NP 转录水平的影响

注：组间两两比较采用LSD 检验，:表示与病毒对照组相比，P<0.05

不同作用时间流感病毒NP 的转录水平-4 h -2 h 0 h 2 h 4 h病毒对照组 3 4.84×106±2.72×105 1.15×107±3.03×105 1.14×107±9.64×105 1.36×107±6.29×105 1.11×107±6.12×105燕窝酶解液组 3 1.93×107±7.91×105a 1.42×107±1.03×106 1.08×106±1.14×105a 1.28×106±3.83×105a 1.35×107±8.43×105a燕窝液组 3 1.61×107±8.91×105a 1.34×107±9.36×105 2.69×106±3.39×104a 2.03×106±3.63×105a 1.81×107±89.13×105a F 值 230.90 5.76 197.00 427.20 29.89 P 值 <0.001 0.040 <0.001 <0.001 <0.001组别 份数

五、燕窝酶解液抑制流感病毒引起的炎症因子表达的结果

表4 和图4 显示，与燕窝液组相比，燕窝酶解液组的病毒 NP、M、炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ、NF-κB 及其家族成员 NF-κBp65 的转录水平均降低（t=-13.15、-15.27、-15.12、-21.31、-4.85、-7.40、-13.77 和-29.39，P 均＜0.05）。 燕窝酶解液处理组的NF-κBp65 及其前体IKK 蛋白的磷酸化程度和蛋白表达量也都降低。

图4 燕窝酶解液抑制NF-κB 的蛋白表达结果

表4 燕窝酶解液对流感病毒基因及炎症因子转录水平的影响

注：NP：流感病毒核蛋白；M：流感病毒基质蛋白

组别 份数 流感病毒基因及炎症因子的转录水平NP M NF-κB NF-κBp65 IL-1β IL-6 TNF-α IFN-γ病毒+燕窝酶解液组 6 0.64±0.12 0.99±0.24 0.29±0.05 0.24±0.03 89.21±12.17 0.018±0.004 8.41±0.99 0.019±0.002病毒+燕窝液组 6 0.89±0.19 1.20±0.32 0.73±0.18 0.49±0.04 304.68±25.86 0.360±0.022 15.91±1.95 0.307±0.005 t 值 -13.15 -15.27 -13.77 -29.39 -15.12 -21.31 -4.85 -7.40 P 值 0.048 0.016 0.027 0.003 <0.001 <0.001 0.002 0.008

讨 论

燕窝水提物可以抑制流感病毒感染犬肾细胞和红细胞血凝反应, 能安全有效预防流感病毒。中性蛋白酶作为一种天然酶制剂，既能够催化分解燕窝中蛋白质为小分子的蛋白、 小肽和游离的氨基酸，同时其本身不会对燕窝的生物学特性产生影响，本文通过对燕窝的酶解提取，探讨其对抗病毒作用的影响，为进一步研究燕窝抗流感机制提供参考。

一、确定了燕窝唾液酸提取率和燕窝酶解液的最大无毒浓度

在最佳液料比和酶解时长条件下，燕窝唾液酸的提取率可以达到（66.87±0.05）%，高于未经酶解的燕窝唾液酸。本研究通过MTT 法测定出燕窝酶解液在细胞上最大无毒浓度为1.22 mg/mL。

二、燕窝酶解液可通过直接作用的方式抑制病毒感染并在感染初期发挥作用

从本文子代病毒产生的结果来看，燕窝酶解液可以通过直接抑制流感病毒和抑制病毒吸附后增殖的2 种方式来降低子代病毒产生量。 从病毒基因NP 和M 的转录水平上看， 燕窝酶解液仅能通过直接抑制的方式降低病毒基因转录，其作用机制可能是酶解液通过影响流感病毒的穿入和内化过程降低了病毒NP 的转录水平。 本文试验结果表明燕窝酶解液和燕窝液主要在病毒孵育初期（0 h）发挥作用，降低病毒基因NP 的转录。 相比燕窝液，燕窝酶解液的效果更好，NP 的表达更低。

三、燕窝酶解液可以降低炎症因子的表达

NF-κB 的激活与流感病毒感染后双向相关，感染早期NF-κB 被激活， 感染后期 NF-κB 参与病毒的复制。 本试验结果显示燕窝酶解液可以直接作用于流感病毒， 降低病毒基因NP 和M 的转录水平，降低 NF-κB 及其前体蛋白的表达。NF-κB 能启动和调控众多参与炎症过程细胞因子和炎症介质的基因表达，但燕窝如何激活免疫信号通路还需要深入研究。

四、结语

综上，酶解过程可以提高燕窝中唾液酸的提取率，制备的燕窝酶解液可以抑制流感病毒转录水平NF-κB 蛋白及调控的炎症因子的表达。 本文结果表明进一步探讨燕窝与流感病毒的作用机制，可以为流感病毒的防治和药物研发提供新的思路。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明

路鑫怡：实验研究、采集数据、分析数据、统计分析、论文撰写及修改；沃恩康，杨新燕，杨灿，徐琦，杨柳，何泳愉，项婷婷：论文修改；郭潮潭：研究指导、论文指导、经费支持