单氰胺水剂高效液相色谱分析方法研究

付萍萍，姜军侠，王玉萍，王素琴

(陕西省农业检验检测中心，陕西 西安 710003)

1 前言

单氰胺化学名称为氰基胺[1]，原药为无色吸湿晶体，熔点为45℃～46℃[2]。该产品属于植物休眠中止剂，通过刺激植物体内过氧化氢酶的活性，加速植物体内氧化磷酸戊糖循环，从而加速了对代谢最为基础的脱氧核糖核酸的生成，导致植物体休眠终止，刺激植物发芽、调节植物生长[1]。本文采用高效液相色谱法，通过对不同流动相的选择，克服了单氰胺标准品称取困难，样品检测过程中单氰胺含量偏高等问题。该方法操作简便、快速，分离效果和稳定性好，且准确度和精密度均能达到定量分析的要求，可作为企业生产过程质量控制和质检机构质量检测的参考方法。

2 试验部分

2.1 试剂和溶液 甲醇：色谱纯；氨水溶液：分析纯；水：超纯水； 单氰胺标样：已知质量分数，ω≥98.5%；单氰胺50%水剂。

2.2 仪器 高效液相色谱仪：Agilent 1 260，具有二极管阵列检测器和自动进样器；Agilent色谱工作站；Millipore超纯水制备系统；色谱柱：250mm×4.6mm(i.d.)不锈钢柱，内装ZORBAX SB-C18；恒温水浴锅。

2.3 液相色谱操作条件 流动相：Ψ(甲醇 ： 水 ： 氨水)=5 ： 95 ： 0.3，经滤膜过滤，并进行脱气；流量：0.7mL/min；柱温：30℃；检测波长：220nm；进样体积：5μL；保留时间：单氰胺约2.9min。

上述液相色谱操作条件，系典型操作参数，可根据不同仪器特点，对给定的操作参数做适当调整，以期获得最佳效果。典型的单氰胺的标样、样品色谱图(图1、图2)。

图1 单氰胺标准品液相色谱图(1—单氰胺 2—双氰胺)

图2 50%单氰胺水剂试样液相色谱图(1—单氰胺 2—双氰胺)

2.4 测定步骤

2.4.1 标样溶液的配制 将单氰胺标准物质置于50±2 ℃水浴中加热到完全转化成液体状态，迅速称取0.05g(精确至0.000 1g)单氰胺标准物质于50mL容量瓶中，加入20mL水，超声波振荡5min，冷却至室温，用水稀释至刻度并摇匀。

2.4.2 试样溶液的配制 称取含0.05g(精确至0.000 1g)单氰胺的试样于50mL容量瓶中，加入20mL水，超声波振荡5min，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀，过滤。

2.4.3 测定 在上述操作条件下，待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，各针相对响应值变化<1.5%时，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进样测定。

2.4.4 计算 将测得的2针试样溶液及试样溶液前后2针标样溶液中单氰胺的峰面积分别进行平均，按下式计算其质量分数(%)：

式中：

A2—试样溶液中单氰胺峰面积的平均值；

m1—标样的质量，g；

ω—标样中单氰胺的质量分数，%；

A1—标样溶液中单氰胺峰面积的平均值；

m2—试样的质量，g。

3 结果分析

3.1 色谱条件选择 色谱柱选择常用的ZORBAX SB-C18反相柱。根据单氰胺物化性质、溶剂的紫外吸收波长，选择水作为溶剂溶解样品。首先选择Ψ(甲醇：3%氨水溶液)=5：95(用磷酸调pH值到6.5左右)流动相，用磷酸调pH值，单氰胺有效成分不能有效分离出来，所测水剂质量分数偏高；其次选择Ψ(甲醇：2mmoL/L乙酸铵水溶液)=5：95，单氰胺有效成分不能有效分离出来，所测水剂质量分数仍然偏高(图3)；然后选择Ψ(甲醇：水：氨水)=5 ： 95 ： 0.3作为流动相，可以将样品中的单氰胺和双氰胺有效分离(图2)，这时候双氰胺在样品中的干扰已消除，单氰胺质量合格，峰纯度达标。

图3 50%单氰胺水剂试样液相色谱图(单氰胺与双氰胺未分开)

3.2 标准溶液配制 单氰胺标准物质是白色结晶状固体，易吸潮结块，称取困难。根据单氰胺的熔点低的特点(熔点45℃)，选择在50±2 ℃水浴中加热至标准物质完全转化为液体，迅速称取标准物质。

图4 单氰胺的紫外光谱图

3.3 检测波长的选择 单氰胺的紫外光谱图(图4)，从图中可以看到单氰胺的最大吸收波长约在210nm处，在该波长处溶剂干扰较大，故将检测波长确定为220nm，干扰少，灵敏度也能够满足分析的要求。

3.4 分析方法的线性相关性试验 按标样溶液的制备方法配制(499～179 7mg/L)5个不同浓度的有效成分线性相关溶液。在上述操作条件下，待仪器稳定后，按照STD1至STD5的顺序测定每个溶液中单氰胺的峰面积，取2次测定的平均结果。以单氰胺质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程和相关系数为Y=2.632 8x+87.364，r=0.999 9，(图5)。

图5 单氰胺线性关系图

3.5 分析方法的精密度试验 按上述色谱操作条件对同一样品平行5次进行测定，测得标准偏差为0.043；变异系数为0.089%。(表1)。

3.6 分析方法的准确度试验 从已知质量分数的样品中称取5个试样，分别加入一定量的单氰胺标准物质，在上述色谱操作条件下进行分析，测得单氰胺质量分数的平均回收率为100.93% (表2)。

表1 分析方法的精密度试验结果

表2 分析方法的准确度试验结果

3.7 方法特异性 本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别单氰胺。单氰胺标样、50%单氰胺水剂中的单氰胺HPLC-DAD峰纯度均>990，有效成分处无其它物质干扰，符合定量分析要求。峰纯度(图6、图7)。

图6 单氰胺标样HPLC-DAD峰纯度色谱图

图7 单氰胺水剂HPLC-DAD峰纯度色谱图

4 结论

综上，本文建立的HPLC分析方法，保留时间合理，精密度与准确度较高，可快速分离测定样品中单氰胺和双氰胺两种成分，且单氰胺线性关系性好，符合农药产品的质量分析要求，对于保证50%单氰胺水剂产品质量，维护消费者的利益起到作用。