苯醚甲环唑在青豆和大豆中的残留及MRL比对分析

刘宇，邱水霞，刘凤娇，朱宇珂，马 成，李 莉*

(1.山西农业大学植物保护学院，山西 太原 030031；2.内蒙古大学生态与环境学院，内蒙古 呼和浩特市 010020；3. 中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理国家重点实验室，北京 100101)

大豆(GlycinemaxL.Merrill)是重要的粮饲兼用作物，富含蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质、油脂以及多种生物活性物质，大豆蛋白含有人体必需的八种氨基酸，相较于动物蛋白具有低热量、不含胆固醇等优点，在我国农业和人体膳食结构中具有重要的不可替代性[1-3]。根据国家统计数据显示，2019年我国大豆播种面积933万公顷(1.4亿亩)。然而，大豆病害带来的一系列问题给农业生产造成了巨大经济损失。我国已报道的大豆病害约40种，一般会造成10%～30%的减产，严重时可达>50%[4]。

苯醚甲环唑(Difenoconazole)是一种三唑类内吸性杀菌剂，具有高效、广谱、安全、持效期长和内吸性强等特性，主要通过抑制病原真菌细胞壁甾醇的生物合成而阻止其生长，对多种蔬菜和果树上的叶斑病、黑斑病、白粉病及疫霉病等具有良好的防治效果[5]。苯醚甲环唑应用广泛，现已登记用于粮食作物、蔬菜、水果、观赏花卉、草坪等61种作物。近年来，对其在西瓜[6]、芹菜[7]、枸杞[8]、甘蓝[9]、香蕉[10，11]、桃[12]、葡萄[13]等农产品中的残留行为有一定的研究。

大豆生长过程中，青豆和大豆都是可食用部位。NY/T788-2018农作物中农药残留试验准则中规定，在评价农药使用安全性时，田间试验需采集青豆(带荚)和大豆籽粒进行检测。过去的研究通过对杭州地区4个产地48个带荚毛豆样品进行检测发现，其中13个样品中苯醚甲环唑残留量高于0.020mg/kg，最高达到0.126mg/kg[14]，造成一定的风险。然而，对于苯醚甲环唑在青豆(带荚)中的残留水平尚未见报道。为此，本文应用超高效液相色谱-串联质谱建立了苯醚甲环唑在青豆(带荚)和大豆中的残留分析方法，测定了农药使用后青豆(带荚)和大豆中残留水平，为制定菜用大豆中的苯醚甲环唑的限量提供依据，同时，还讨论了在代表性作物中的最大残留限量差异，为我国大豆进出口贸易中苯醚甲环唑的测定提供预警。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 试验仪器：Waters TQD超高效液相色谱-串联质谱联用仪；KQ-600超声波清洗器；FC 5706台式低速离心机；精密移液枪(Eppendorf)；HM294均质机；CS-700高速粉碎机；MTV-100多管涡旋混合仪；CK2000高通量组织研磨仪。

苯醚甲环唑标准品：纯度96.3%，由Dr. Ehrenstorfer Gmbh提供；乙腈(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；氯化钠(分析纯)。

1.2 试验设计

1.2.1 田间试验设计 依据NY/T788-2018《农作物中农药残留试验准则》[15]和农业农村部《农药登记残留试验区域指南》(农药检(残留)[2018]18号[16]，于2020年在黑龙江省肇东市、内蒙古乌兰察布市、辽宁省沈阳市、山西省长治市、北京市昌平区、山东省泰安市、上海市松江区、安徽省宿州市、湖南省长沙市、广西区南宁市进行(各地的作物品种、气候因子以及土壤属性) (表1)。试验作物为大豆，被试农药为200g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑悬浮剂(只测定苯醚甲环唑)。

表1 田间实验地点、作物品种、气候因子及土壤条件

1.2.2 最终残留试验 按要求设计3个试验小区：1个对照小区和2个处理小区，每个小区面积100m2，小区之间设保护行进行有效隔离。施药时期为青豆(带荚)和大豆采收前21d，200g/L氟唑菌酰羟胺·苯醚甲环唑悬浮剂(其中苯醚甲环唑125g/L)以240g.a.i./ha的剂量喷雾3次，施药间隔期7d，于末次施药后7、10、14d在青豆和大豆处理区分别采集青豆(带荚)和大豆样品，第1次和最后1次采集处理区样品的同时采集青豆(带荚)和大豆对照样品。

1.2.3 样品采集、制备与储存 青豆(带荚)样本：将青豆田间样本去除茎杆，保留豆荚，充分混匀，用四分法取150g装入可封口样品袋中，贴好标签后立即放入<-18℃冰箱中待测。

大豆最终：将大豆田间样本去除枯叶、秸秆和外壳，充分混匀后，用四分法取150g装入封口样品袋中，贴好标签后立即放入<-18℃冰箱中待测。

1.3 分析方法

1.3.1 样品提取 大豆：准确称取粉碎后的大豆样品10g(±0.05g)于50mL离心管中，加入乙腈10mL，甲酸0.1mL，超纯水10mL，充分混匀，超声提取15min，加入6g氯化钠，高通量研磨仪震荡1min，3 000r/min下离心5min，待净化。

带荚青豆：准确称取粉碎后的样品5g(±0.05g)，加入乙腈10mL，甲酸0.1mL，超纯水5mL，充分混匀，以下步骤同大豆样品。

1.3.2 净化 取1.7mL大豆样品上清液加入装有50mg C18+150mg MgSO4的2mL净化管中，2 500r/min涡旋5min后高速离心机10 000r/min离心3min，上清液过0.22μm 滤膜后，待HPLC-MS/MS检测。取1.7mL青豆(带荚)样品上清液加入装有 50mg PSA+150mg MgSO4+50mg C18+10mg PC的2mL净化管中，以下步骤同大豆样品。

1.3.3 仪器条件 色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：25℃；流速：0.4mL/ min；进样量：3μL；梯度洗脱条件(表2)。

表2 梯度洗脱条件

质谱条件：离子源：电喷雾离子源ESI；扫描方式：正离子源；毛细管电压：3.0KV；锥孔电压：25V；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：300℃；脱溶剂气流量：650L/h；锥孔气流量：0L/h；检测方式：多重反应监测(MRM)；其他主要质谱参数(表3)。

表3 苯醚甲环唑的主要质谱参数

1.4 添加回收试验 在空白样品中添加4个水平苯醚甲环唑标准溶液，每个水平重复5次。添加水平为0.010、0.050、0.40、1.0mg/kg，按上述方法进行分析，计算添加回收率及RSD。

1.5 基质效应评价

(1)

基质效应(Matrix Effect，简称ME)评价标准：(1)若ME≥20%，表明存在基质效应，应采用基质配制的标准溶液制作标准曲线；(2)若ME<20%，表明基质效应可忽略，可采用纯溶剂配制的标准溶液制作标准曲线[17]。

2 结果与分析

2.1 方法有效性评价 大豆和青豆(带荚)样品中苯醚甲环唑的分析方法基于QuEChERS方法建立，根据两种基质的不同特点，筛选出适合的分散固相萃取吸附剂，对方法的基质效应、正确度、定量限和重复性进行了评价。在0.010～1.0mg/L范围苯醚甲环唑在溶剂、大豆和青豆基质空白液中的的质量浓度(x)与峰面积(y)之间具有良好的线性关系，标准曲线和相关系数(表4)。苯醚甲环唑在大豆中的基质效应ME值为-62%，在带荚青豆中的基质效应ME值为-28%，因此，试验中使用液相色谱串联质谱测定苯醚甲环唑表现出基质抑制效应，且基质效应显著，因此本试验样品检测使用大豆、青豆(带荚)基质标准曲线进行定量分析。

表4 苯醚甲环唑在不同基质中的标准曲线

按照1.3的方法，在大豆样品中，苯醚甲环唑的平均回收率为84%～96%，相对标准偏差为2.0%～7.2%；在青豆(带荚)样品中，苯醚甲环唑的平均回收率为79%～89%，相对标准偏差为1.9%～7.8%，建立的分析方法在灵敏度，重复性等均可以满足农药残留检测要求(表5)。

表5 苯醚甲环唑在各地青豆(带荚)和大豆中的添加回收率及相对标准偏差

2.2 最终残留量 按照苯醚甲环唑有效成分150g a.i./ha，喷雾3次，施药间隔期7d，末次施药后7、10、14d后采集青豆(带荚)和大豆样品，不同地区因耕作制度、用药习惯、气候条件等的差异，苯醚甲环唑在青豆(带荚)和大豆上的残留量有一定差异。采收间隔期为7、10、14d时，大豆中的残留范围分别为<0.01～0.085mg/kg、<0.01～0.057mg/kg、<0.01～0.086mg/kg。施药7d后，黑龙江肇东、内蒙古乌兰察布、山西长治以及广西南宁四产地中苯醚甲环唑在大豆中的最终残留量分别为0.097、0.051、0.069、0.085mg/kg，均>0.05mg/kg；施药10d后，黑龙江肇东、内蒙古乌兰察布两产地的残留量分别为0.057、0.051，均>0.05mg/kg；在施药14d后，安徽宿州和广西的残留值为0.057和0.086mg/kg，>0.05mg/kg，高于我国食品安全国家标准GB2763-2021中规定的MRL值0.05mg/kg(表7)。

苯醚甲环唑在10个不同地区的青豆(带荚)中的最终残留量(表6)，采收间隔期为7d时残留量在0.24～1.67mg/kg，10d时为0.21～1.89mg/kg，14d时为0.12～1.65mg/kg。残留量以广西区南宁市和安徽省宿州市相对较高，可能与当地种植方式、大豆生长期有关。目前，我国GB2763-2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中制定了菜用大豆(籽粒，去荚)的限量标准，但对于食品青豆(带荚)未做规定。青豆(带荚)经加工处理、速冻冷藏后出口日本、欧美等国家，经济效益显著[18]，然而，近年青豆(带荚)出口因农药残留超标问题引发的外贸退赔时有发生[14]，建议增加相关限量标准。

表6 苯醚甲环唑在各地大豆和青豆中的残留量

2.3 MRL比对分析 不同国家或地区对农作物中的残留限量从数量和限量值方面都存在差异，从而可能影响国际贸易。张利真等对比了我国与国际食品法典委员会、欧盟、日本、韩国、美国等5个国家地区或组织关于毛豆(菜用大豆)中的最大残留限量，我国标准中共有91种农药的限量值适用于菜用大豆；CAC标准涉及豆类蔬菜中15种农药的残留限量值；欧盟法规涉及豆类蔬菜中408种农药的残留限量值；美国在40 CFR 180中公布了豆类蔬菜中48种农药的残留限量值[18]。

表7中对于苯醚甲环唑在部分农作物中的最大残留限量进行了罗列、比较，其中，我国制定的玉米、草莓中苯醚甲环唑的限量均宽松与其他国家或组织，大豆和马铃薯中的最大残留限量较其他国家或组织严格。对于农作物中农药的规定宽松于其他国家或地区的情况，蔬菜生产者和贸易商除需符合我国规定最大残留限量之外，还应严格用药管理和农事操作，确保农产品质量符合进口国(地区)规定，保证出口贸易顺利[19]；对于我国标准中限量严格于其他国家或地区的情况，应加强监管，进口时农产品质量安全需符合我国的标准要求，以保障我国人民的膳食安全。

GB 2763-2021规定了564种农药在376种(类)食品中10092项最大残留限量标准[20]，为确保残留限量标准的科学性和适用性，建议农药残留限量标准修订工作结合实际生产、进出口贸易等情况、以试验数据为依据及时进行更新[19]。

表7 部分农产品中苯醚甲环唑最大残留限量(MRL)值

3 结论

本实验基于UPLC-MS/MS建立了苯醚甲环唑在大豆和带荚青豆中的残留检测方法，该方法操作简单，其准确度和精密度均满足农药残留检测要求，通过规范残留试验得到我国10个大豆主要生产区域青豆(带荚)和大豆中的最终残留水平，残留量因地区、气候、作物种类等存在差异，采样间隔为7、10、14d时在青豆(带荚)中和大豆的残留量分别为0.24～1.67mg/kg、0.21～1.89mg/kg、0.12～1.65mg/kg，为我国制定苯醚甲环唑在菜用大豆中的MRL制定提供数据支持。在采收间隔期为14d时，大豆中的残留量为<0.01～0.086mg/kg。通过对我国和其他国际组织和国家的最大残留限量比对，为农产品进口和标准制定提出建议。